جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری‌های حذف‌کننده فسفات از پساب‌ صنعتی

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، دانشکده علوم پایه، گروه میکروب‌شناسی، سمنان، ایران.

2 دکترای تخصصی میکروبیولوژی، مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی قم، قم، ایران.

3 دانشیار قارچ‌شناسی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد گرگان، دانشکده علوم پایه، گروه میکروب‌شناسی، گلستان، ایران.

4 دانشجوی دکترای تخصصی میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم، دانشکده علوم پایه، گروه میکروب‌شناسی، قم، ایران.

5 دکترای تخصصی میکروبیولوژی، گروه میکروب‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران.

چکیده

زمینه و هدف: فسفات­ از مهم­ترین آلایند­ه­های وارد شونده به آب­های پذیرنده (رودخانه­ها، دریاچه­ها و دریاها) از طریق دفع پساب­ها است که باعث غنی شدن پیکره آبی و پدیده یوتریفیکاسیون می­گردد. میکروارگانیسم­های حذف کننده فسفات در فرآیند زیست­پالایی، فسفات موجود در پساپ را به صورت پلی­فسفات داخل سلولی در خود ذخیره و از محیط حذف می­کنند. این مطالعه به منظور جداسازی و شناسایی باکتری­های حذف کننده فسفات از پساب­های صنعتی صورت گرفت.
روش بررسی: در این مطالعه، باکتری­های حذف کننده فسفات از نمونه­های پساب شهرک صنعتی آق­قلا استان گلستان جداسازی شدند. جدایه­های باکتری با استفاده از محیط اختصاصی Seperb و بر اساس تشکیل هاله شفاف در محیط کشت غربال­گری شده و با استفاده از روش­های ماکروسکوپی، میکروسکوپی، بیوشیمیایی و نهایتاً مولکولی شناسایی گردیدند.
یافته‌ها: تعداد 3 جدایه از بین جدایه­های حذف کننده فسفات با توجه به ایجاد هاله وسیع­تر در محیط کشت، توانایی قابل ملاحظه­ای را در حذف فسفات داشتند. شناسایی مولکولی جدایه­ها با استفاده از روش تایپینگ مولکولی بر پایه تکثیر قطعه ژنی 16S rDNA نشان داد که این جدایه­ها منسوب به سه جنس Brevundimonas،  OchrobactrumوExiguobacteriumبودند.
بحث و نتیجه‌گیری: آنالیز واریانس در سطح 05/0 درصد با استفاده از نرم­افزار آماری SAS 9.2 تفاوت معنی­داری را در حذف فسفات توسط جدایه­ها نشان داد. جدایه­های مورد مطالعه در این پژوهش پتانسیل بالقوه­ای را در فسفات­زدایی از پساب دارند و کاندیدای مناسبی در زیست­پالایی به همراه سایر روش­ها هستند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


 

 

 

 

 

علوم و تکنولوژی محیط زیست، دوره نوزدهم،ویژه­نامه شماره 5، تابستان 1396

 

جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری­های حذف­کننده فسفات از پساب­ صنعتی

سید حسین حسینی [1]

مریم طبیبی [2]

حمیدرضا پردلی [3]

رضا نجف­پور [4]

فاطمه کریمی 4

سجاد یزدان ستاد [5]*

sajjad.yazdansetad@gmail.com

تاریخ دریافت: 11/01/1394

 

تاریخ پذیرش:26/08/1394

چکیده

زمینه و هدف: فسفات­ از مهم­ترین آلایند­ه­های وارد شونده به آب­های پذیرنده (رودخانه­ها، دریاچه­ها و دریاها) از طریق دفع پساب­ها است که باعث غنی شدن پیکره آبی و پدیده یوتریفیکاسیون می­گردد. میکروارگانیسم­های حذف کننده فسفات در فرآیند زیست­پالایی، فسفات موجود در پساپ را به صورت پلی­فسفات داخل سلولی در خود ذخیره و از محیط حذف می­کنند. این مطالعه به منظور جداسازی و شناسایی باکتری­های حذف کننده فسفات از پساب­های صنعتی صورت گرفت.

روش بررسی: در این مطالعه، باکتری­های حذف کننده فسفات از نمونه­های پساب شهرک صنعتی آق­قلا استان گلستان جداسازی شدند. جدایه­های باکتری با استفاده از محیط اختصاصی Seperb و بر اساس تشکیل هاله شفاف در محیط کشت غربال­گری شده و با استفاده از روش­های ماکروسکوپی، میکروسکوپی، بیوشیمیایی و نهایتاً مولکولی شناسایی گردیدند.

یافته‌ها: تعداد 3 جدایه از بین جدایه­های حذف کننده فسفات با توجه به ایجاد هاله وسیع­تر در محیط کشت، توانایی قابل ملاحظه­ای را در حذف فسفات داشتند. شناسایی مولکولی جدایه­ها با استفاده از روش تایپینگ مولکولی بر پایه تکثیر قطعه ژنی 16S rDNA نشان داد که این جدایه­ها منسوب به سه جنس Brevundimonas،  OchrobactrumوExiguobacteriumبودند.

بحث و نتیجه‌گیری: آنالیز واریانس در سطح 05/0 درصد با استفاده از نرم­افزار آماری SAS 9.2 تفاوت معنی­داری را در حذف فسفات توسط جدایه­ها نشان داد. جدایه­های مورد مطالعه در این پژوهش پتانسیل بالقوه­ای را در فسفات­زدایی از پساب دارند و کاندیدای مناسبی در زیست­پالایی به همراه سایر روش­ها هستند.

واژه­های کلیدی: باکتری­های حذف­کننده فسفات، زیست­پالایی، پساب، آلاینده.

 

Isolation and molecular identification of the bacteria involved in removing phosphate from industrial wastewater

 

Seyed Hossein Hosseini [6]

Maryam Tabibi [7]

Hamidreza Pordeli [8]

Reza Najafpour [9]

Fatemeh Karimi 4

Sajjad Yazdansetad [10]*

sajjad.yazdansetad@gmail.com

 

Abstract

Background and Objective: Phosphate is one of the most important contaminants entering recipient waters (rivers, lakes, and seas) by wastewater disposal and causative agent of eutrophication due to the enrichment of aquatic ecosystems. In bioremediation process, the phosphate-removing bacteria accumulate polyphosphate intracellularly and take it away from the environment. The objective of this study was to isolate and identify the bacteria which remove phosphate from industrial wastewater.

Method: In this study, phosphate-removing bacteria were isolated from wastewaters of Aq Qlala industrial park of Golestan province. The isolates were identified based on the creation of clear zone in the bacterial lawn, leading to phosphate removal on the specific agar plate Seperb. Finally, the isolates were identified by macroscopical, microscopical, biochemical, and molecular methods.

Findings: In total, 3 out of 30 isolates had high ability in phosphate removal regarding their large clear zone on agar. Molecular identification of isolates by 16S rDNA typing method indicated that the isolates belong to the genera Brevundimonas, Ochrobactrum, Exiguobacterium.

Conclusion: Variance analysis using SAS 9.2 software indicated a significant difference in phosphate removal by the isolates. The obtained results demonstrated that the isolates are highly efficient in phosphate removing from wastewater and they are suitable candidates for bioremediation along with other methods.

Keywords: Phosphate-removing bacteria, Bioremediation, Wastewater, Contaminant.

 

مقدمه

 

امروزه ورود آلاینده­های شیمیایی ناشی از فعالیت­های صنعتی و کشاورزی از مهم­ترین معضلات زیست­محیطی است. آب­های پذیرنده شامل رودخانه­ها، دریاچه­ها و دریاها محل­ نهایی ورود این آلاینده­ها از طریق دفع فاضلاب­ها و پساب­ها هستند. از مهم­ترین آلاینده­هایی که بدین شکل وارد آب­های پذیرنده می­شوند، ترکیبات مغذی خصوصاً نیترات­ها و فسفات­ها هستند. ترکیبات مغذی فسفاتی وارد پیکره آبی شده و باعث افزایش رشد و تکثیر گیاهان آبزی و به طور خاص جلبک­ها و سیانوباکترها شده که به پدیده یوتریفیکاسیون[11] موسوم است (1). یوتریفیکاسیون اثرات مخرب زیادی را روی اکوسیستم­های آبی و در نهایت بر روی حیوانات و انسان می­گذارد، به طوری که با رشد بیش از اندازه جلبک­ها در سطح آب و ایجاد کف از نفوذ اکسیژن به آب ممانعت شده و باعث مرگ ماهی­ها و دیگر آبزیان و تغییر چرخه­ تغذیه­ای اعماق آب می­گردد. از آن­­جایی که حذف هر آلاینده متناسب با اهمیت بهداشتی و زیست محیطی آن است، حذف عناصر مغذی نیز با پیدایش پدیده یوتریفیکاسیون در منابع آبی اهمیت ویژه پیدا کرده است (2).

فسفات به دلایل مختلف از جمله اهمیت آن در سنتز اسیدهای نوکلییک، سنتز ATP، تولید مکمل­های پر انرژی و ذخیره­سازی انرژی، فرآیندهای غشای سلولی و عامل مهم کنترل کننده رشد سلولی در میکروارگانیسم­ها حایز اهمیت است (3). در نتیجه، تلاش­هایی در جهت حذف فسفات توسط میکروارگانیسم­ها با فرآیند افزایش زیستی حذف فسفات[12] (EBPR) صورت گرفته است. بدین ترتیب فسفات توسط میکروارگانیسم­ها از توده پساب جذب و به عنوان پلی­فسفات داخل سلولی ذخیره می­شود. پلی فسفات یک ترکیب با انرژی بالاست و هیدرولیز آن انرژی واکنش­های بیوشیمیایی سلول را تأمین می­نماید (4). در واقع، افزایش زیستی حذف فسفات در یک الگوی بی­هوازی­هوازی تصفیه فاضلاب انجام می­شود. در مرحله بی­هوازی، فسفات در میکروارگانیسم­های جمع کننده فسفات[13] (PAOs) تجمع می­یابد و با زنجیره کوتاه اسیدهای آلی موجود در فاضلاب، آلکانوات­ پلی هیدروکسیل[14] (PHA) داخل سلولی را تشکیل می­دهد که با هیدرولیز پلی فسفات داخل سلولی انرژی مورد نیاز برای جداسازی اسیدهای آلی تامین می­شود. در مرحله هوازی، آلکانوات­ پلی هیدروکسیل صرف تولید انرژی برای رشد باکتری­های جمع کننده فسفات می­گردد. مقدار فسفات حذف شده از فاضلاب در مرحلۀ هوازی بیشتر از مقدار حذف شده آن در مرحله بی­هوازی است (5). مهم­ترین باکتری­های حذف کننده فسفات متعلق به جنس­های آسینتوباکتر[15]، سودوموناس[16]­، بورخولدریا[17]، بروندیموناس[18]، فلاوباکتریوم[19] و کورینه­باکتریوم[20] هستند (6). پاشایوا[21]و همکاران باکتری­های حذف کننده فسفـــات ســودومــونــاس آئروژینوزا[22] و آسینتوباکتر بومانی[23] را از پســاب شهر ازمیــر[24] در ترکیــه جـــداســازی کــردنــد (7). لیلا بنامار[25] و همکاران باکتری­های حذف کننده فسفات سودوموناس آئروژینوزا، آسینتوباکتر ژونی[26]، آلکالیژنز دنیتریفیکانس[27] و مواکسلا لاکوناتا[28] را از لجن فعال جدا کردند (8).

کنترل و برنامه­ریزی در جهت حذف و یا به حداقل رساندن آلاینده­های زیست­محیطی یک امر ضروری است. حذف آلاینده­هابا روش­های شیمیایی اغلب هزینه­بر بوده و گاهی نیز به دلیل سمیت مواد اضافه شده، به محیط آسیب وارد می­کند. امروزه حذف بیولوژیکی آلاینده­ها توسط میکروارگانیسم­ها تحت عنوان زیست­درمانی[29] به دلیل هزینه پایین، کم خطر بودن و توانایی حذف موثر آلاینده­ها مورد توجه قرار گرفته است (2). مطالعه حاضر به منظور جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری­های حذف کننده فسفات از پساب­های صنعتی استان گلستان انجام گرفت.

مواد و روش­ها

نمونه برداری

نمونه­برداری از پساب کارخانجات صنعتی و مراکز تولیدی فعال شهرک صنعتی آق قلا استان گلستان (واقع در کیلومتر 12 جاده گرگان-آق قلا) در چندین بازه­ زمانی مختلف و با در نظر گرفتن پارامترهای اولیه شامل شرایط فیزیکی و شیمیایی، pH و درجه حرارت پساب انجام گرفت. نمونه در ظرف حاوی یخ به سرعت به آزمایشگاه منتقل گردید.

غنی­سازی پساب

جهت غنی­سازی پساب، 90 میلی­لیتر از نمونه پساب با 10 میلی­لیتر محلول پتاسیم دی هیدروژن فسفات (KH2PO4) 1 درصد، مخلوط شده و به مدت 48 ساعت در 25 درجه سلسیوس در شیکر انکوباتور با 150 دور در دقیقه قرار داده شد. در مرحله بعد، 30 میلی­لیتر از نمونه به 75 میلی­لیتر محیط نوترینت براث غنی شده با فسفات انتقال یافت و به مدت 5 روز در 25 درجه سلسیوس در شیکر انکوباتور قرار داده شد (9).

کشت نمونه پساب

از نمونه­های غنی شده پساب با استفاده از نرمال سالین استریل 2/0 درصد، رقت­های متوالی از 1-10 تا 9-10 تهیه شد. 100 میکرولیتر از هر رقت سریالی­ روی محیط اختصاصی Seperb (گلوکز 10 گرم بر لیتر، عصاره مخمر 5/0 گرم بر لیتر، کلرید کلسیم 1/0 گرم بر لیتر، تری فسفات کلسیم 5/2 گرم بر لیتر، سولفات منیزیم 25/0 گرم بر لیتر، آگار 15 گرم بر لیتر، و تنظیم شده در 2/7 pH) کشت داده شد. هم­ چنین، برای انتخابی کردن محیط و جلوگیری از رشد قارچ­ها، آنتی­بیوتیک سیکلوهگزامید با غلظت 500 میلی­گرم بر لیتر به محیط کشت اضافه گردید. پلیت­ها در 25 درجه سلسیوس به مدت 7 روز در گرم­خانه قرار داده شد. جهت غربال­گری باکتری­های حذف کننده فسفات، از روش لکه­گذاری و ایجاد هاله شفاف در اطراف کلنی باکتری­ها در محیط اختصاصی Seperb استفاده گردید(10).

شناسایی جدایه­ها

جدایه­های حذف کننده فسفات از نظر مورفولوژیکی و واکنش گرم بررسی و با استفاده از آزمون­های بیوشیمیایی، اکسیداز، کاتالاز، تولید H2S، بررسی حرکت، تولید اندول از تریپتوفان، [30]MR-VP، مصرف سیترات، تجزیه نشاسته، تجزیه ژلاتین،  تجزیه کازیین، اکسیداسیون یا تخمیر قندها (OF[31])، مصرف اوره و احیای نیترات شناسایی شدند (11).

استخراج DNA باکتری­ها

استخراج DNA باکتری­ها با استفاده از کیت استخراج DNA کیاژن (کیاژن، آلمان[32]) انجام گرفت.

تکثیر قطعه 16SrDNA باکتری­ها با استفاده از واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR)

واکنش زنجیره­ای پلیمراز  با حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل 10 نانوگرم بر میکرولیتر DNA الگو، 4/0 میکرومولار از هر پرایمر فوروارد و ریورس، 2/0 میلی­مولارdNTP ، 2 میلی­مولار MgCl2، 5/2 میکرولیتر بافر PCR و 1 واحد آنزیم Taq DNA Polymerase انجام گردید. واکنش PCR با روش استاندارد (13) و با استفاده از پرایمرهای عمومی (F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', R: 5'-GACGGGCGGTGTGTACAA-3') در دستگاه ترمال سایکلر (اپندورف، آلمان[33]) تحت شرایط دمایی 5 دقیقه واسرشت شدن اولیه در دمای 94 درجه سانتی­گراد و در ادامه 35 چرخه شامل واسرشت شدن در دمای 94 درجه سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه، اتصال در دمای 45 درجه سانتی­گراد به مدت 30 ثانیه، طویل شدن در دمای 72 درجه سانتی­گراد به مدت 90 ثانیه و در نهایت طویل شدن نهایی در دمای 72 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه انجام گرفت (12). در نهایت، قطعه تکثیر شده جهت تعیین توالی به شرکت ماکروژن کره جنوبی[34] ارسال گردید.

ارزیابی کمی حذف فسفات توسط جدایه­های باکتریایی

جهت بررسی توانایی حذف فسفات توسط جدایه­ها از روش ایجاد چاهک در محیط اختصاصی Seperb استفاده شد. ابتدا از جدایه­های باکتریایی سوسپانسیون معادل نیم مک­ فارلند تهیه شد. سپس، سوسپانسیون با روش کشت متراکم روی محیط Seperb کشت داده شد. با انتهای پیپت پاستور شیشه­ای استریل در محیط جامد چاهک­هایی به قطر 4 میلی­متر ایجاد شد. سوسپانسیون باکتری­ها در 10000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ و از مایع رویی به مقدار 30 میکرولیتر در چاهک­ها­ بارگذاری شد و به مدت 10 روز در 25 درجه سلسیوس به منظور اندازه­گیری هاله ناشی از حذف فسفات قرار داده شد (13). واریانس و تحلیل داده­های کمی مربوط به حذف فسفات توسط باکتری­ها با استفاده از سیستم آنالیز آماری (SAS 9.2) انجام گرفت.

تعیین میزان جذب فسفات توسط جدایه­های باکتریایی

برای تعیین میزان جذب فسفات توسط جدایه­های باکتریایی ابتدا 10 میلی­لیتر از محیط کشت اختصاصیSeperb  مایع به عنوان نمونه شاهد به یک لوله­ آزمایش انتقال یافت و طول موج جذب نوری آن با اسپکتروفتومتر (Hach, USA) مدل DR 5000™ UV-Vis سنجیده شد. سپس، سوسپانسیون باکتری­ها با محلول نیم مک­ فارلند معادل سازی گردید و به مقدار 20 میکرولیتر به محیط تهیه شده فوق اضافه شد. بعد از 48 ساعت گرماگذاری در 35 درجه سلسیوس، مقدار جذب نوری دومرتبه سنجش گردید (13).

نتایج

نمونه­برداری و جداسازی باکتری­های حذف­کننده فسفات

جداسازی باکتری­های حذف کننده فسفات با در نظر گرفتن شاخصه­های محیطی نمونه­های پساب جمع­آوری شده از تصفیه خانه مرکزی شهرک صنعتی آق­قلا انجام گرفت. درجه حرارت متوسط نمونه­های پساب در زمان نمونه­گیری 27 درجه سلسیوس و pH متوسط نمونه­های پساب 2/6 برآورد گردید. در مجموع از 50 باکتری جدا شده از پساب، تعداد 30 باکتری با توانایی حذف فسفات، جداسازی و خالص سازی شدند (شکل1).

 

 

 

شکل1- جداسازی باکتری­های حذف­کننده فسفات در محیط کشت  Seperb(هاله شفاف اطراف کلنی­ باکتری، تجزیه فسفات را نشان می­دهد.)

Figure 1- Phosphate-removing bacteria isolated in Seperb medium (Clear zone around the colonies indicated phosphate degradation.)

 

شناسایی باکتری­های حذف کننده فسفات

همه باکتری­های جدا شده بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی، بیوشیمیایی (جدول1) و روش ملکولی بر پایه PCR تا سطح جنس و گونه شناسایی شدند.

 

 


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول1- نتایج آزمون­های بیوشیمیایی

Table1- Results of biochemical tests

 

* آزمون­های بیوشیمیایی: *1- اکسیداز، *2- کاتالاز، *3- تولید H2*4- بررسی حرکت، *5- تولید ایندول از تریپتوفان، *6- MR (Methyl Red)، *7- VP (Voges Proskauer)، *8- مصرف سیترات، *9- تجزیۀ نشاسته، *10- تجزیه ژلاتین، *11- تجزیه کازیین، *12-OF (Oxidation-Fermentation) ، *13- مصرف اوره، *14- احیای نیترات

 


ارزیابی کیفی و کمی حذف فسفات توسط جدایه­ها

جدایه­ها از نظر قطر هاله ناشی از حذف فسفات در اطراف چاهک موجود در محیط کشت انتخاب شدند (شکل2). نتایج کمی مربوط به توانایی این جدایه­ها در حذف فسفات به تفکیک در جدول(2) آورده شده است. از بین 30 جدایه حذف کننده فسفات، جدایه­های PRB 9، PRB 15، PRB 11 و PRB 30بیشترین توانایی را در حذف فسفات داشتند (نمودار1).


 

 

 

شکل2-هاله ناشی از حذف فسفات در اطراف چاهک توسط جدایه­ها در محیط Seperb

Figure2- Clear zonecaused by phosphate-removing bacteria around the well in Seperb medium

 

جدول2- قطر هاله ناشی از حذف فسفات توسط جدایه­ها در مدت 10 روز

Table2- Clear zone diameter created by phosphate-removing bacteria within 10 days

قطر به میلی­متر

 

روز دهم

روز نهم

روز هشتم

روز هفتم

روز ششم

روز پنجم

 

 

 

روز چهارم

روز سوم

روز دوم

روز اول

جدایه

10

10

9

8

7

7

6

5

4

4

PRB 1

11

11

11

10

9

9

7

6

5

4

PRB 2

16

16

15

14

13

12

10

8

6

4

PRB 3

13

13

13

12

12

11

10

8

6

4

PRB 4

13

13

13

12

12

11

10

8

6

4

PRB 5

16

16

15

14

13

12

11

8

6

4

PRB 6

7

7

7

6

6

6

5

4

4

4

PRB 7

7

7

7

6

6

6

5

5

4

4

PRB 8

32

32

30

27

24

21

17

13

9

4

PRB 9

8

8

8

7

6

6

5

4

4

4

PRB 10

33

31

29

26

24

22

19

14

8

4

PRB 11

10

10

10

9

9

8

7

6

5

4

PRB 12

18

18

18

17

16

15

13

11

7

4

PRB 13

18

18

18

17

16

14

12

10

7

4

PRB 14

32

31

30

29

26

24

20

14

9

4

PRB 15

28

28

27

25

23

20

17

14

8

4

PRB 16

22

22

21

19

16

13

10

7

6

4

PRB 17

14

14

13

12

10

8

6

6

5

4

PRB 18

17

16

16

15

13

11

9

7

6

4

PRB 19

17

17

17

16

13

11

8

8

6

4

PRB 20

13

13

12

12

11

10

9

9

6

4

PRB 21

18

18

17

16

14

12

9

9

7

4

PRB 22

13

13

13

13

13

12

11

10

9

4

PRB 23

23

23

22

20

17

15

13

10

9

4

PRB 24

13

13

12

11

10

9

8

7

7

4

PRB 25

13

13

12

12

11

9

7

6

5

4

PRB 26

26

25

24

21

17

14

11

9

6

4

PRB 27

23

22

21

20

19

18

16

14

12

4

PRB 28

17

17

16

15

14

13

11

10

8

4

PRB 29

33

33

31

29

26

24

20

15

10

4

PRB 30

 

نمودار1- مقایسه قطر هاله ناشی از حذف فسفات توسط جدایه­ها

Chart 1- Comparison of clear zone diameter of phosphate removal in bacterial isolates

 

 

نتایج آنالیز واریانس در سطح 05/0 درصد با استفاده از نرم­افزار آماری SAS 9.2 نشان داد که بیشترین هاله ایجاد شده در تیمارهای PRB9، PRB15،PRB11  وPRB30  مشاهده شد. بین این تیمارها تفاوت معنی­داری از لحاظ آماری مشاهده نشد، در حالی که بین این تیمارها با دیگر تیمارهای مورد بررسی تفاوت معنی­دار در سطح 05/0 درصد مشاهده شد.

تعیین میزان جذب فسفات توسط جدایه­های باکتریایی

میزان جذب فسفات توسط جدایه­های باکتریایی به تفکیک برای PRB9، PRB11، PRB15 و PRB30 در جدول(3)
آورده شده است.

تکثیر قطعه 16S rDNA جدایه­های باکتری با استفاده از واکنش PCR

تکثیر قطعه ژنی16S rDNA جدایه­ها باند مناسب در اندازه حدوداً 1500 جفت باز را نشان داد (شکل3). توالی تعیین شده قطعه ژنی با نرم­افزار بلاست[35] موجود در وب سایت NCBI[36]  بررسی شد و درصد شباهت جدایه­ها با دیگر باکتری­های موجود در بانک اطلاعاتی مقایسه گردید (جدول 4).

 

 


جدول3- میزان جذب فسفات توسط جدایه­های PRB

Table3- The phosphate absorption by PRB isolates

جذب

کنترل

PRB 9

PRB 11

PRB 15

PRB 30

عدد جذب اولیه

88/0

89/0

89/0

89/0

89/0

عدد جذب بعد از 48 ساعت

89/0

530/0

521/0

510/0

509/0

میزان جذب فسفات

0

360/0

369/0

380/0

381/0

 

 

شکل3- تکثیر قطعه ژنی16S rDNA جدایه­ها

Figure3- Amplification of 16S rDNA of isolates

 

جدول4- اطلاعات مقایسه توالی قطعه ژنی 16S rDNA جدایه­ها با بانک اطلاعاتی NCBI

Table4- Comparison of 16S rDNA gene sequence of isolates with NCBI Database

Accession number

Similarity

Species

Isolate

KC252887.1

98%

Brevundimonas diminuta

PRB 9

NR075006.1

99%

Exiguobacterium sibiricum

PRB 11

FJ950547.1

99%

Ochrobactrum grignonense

PRB 15

AJ867295.1

99%

Ochrobactrum anthropi

PRB 30


 

بحث و نتیجه­گیری

 

وجود مواد مغذی به ویژه فسفات­ در فاضلاب­ از مهم­ترین آلاینده­های منابع آبی و از نگرانی­های عمده زیست­محیطی است. تقریبا 25 درصد مشکلات آلودگی آب­ها مربوط به وجود دو ماده مغذی فسفات و نیترات است (1). فسفات موجود در فاضلاب در مقادیر اندک، در حد میکروگرم بر لیتر باعث رشد بی­رویه جلبک­ها­ می­شود که این پدیده پیامدهایی هم­چون کاهش اکسیژن محلول، تلف شدن آبزیان، تیرگی و کاهش کیفیت آب را دارد. علاوه بر آن، رشد بی­رویه جلبک­ها باعث افزایش میزان کلریناسیون در آب شده که این امر به نوبه خود باعث افزایش خطر ابتلا به سرطان می­شود (2). در نتیجه حذف فسفات از فاضلاب در پایین­ترین سطح ممکن اهمیت خاصی پیدا می­کند. حذف فسفات در روش­های بیولوژیکی با استفاده از میکروارگانیسم­های حذف کننده فسفات صورت می­گیرد. (14).

در این مطالعه باکتری­های حذف کننده فسفات از پساب­ واحدهای تولیدی شهرک صنعتی آق­قلا استان گلستان جداسازی شد و در سه جنس بروندیموناس، اوکروبکترم و اگزیگوبکتریوم شناسایی گردید. به طور مشابه، هاپفر[37] و گلوس[38] (15) و تاهریون و همکاران (4) باکتری­های بروندیموناس و  اگزیگوبکتریوم را از پساب جدا کردند و به عنوان باکتری­های حذف کنندۀ فسفات معرفی نمودند.

بردجانویک[39] و همکاران نیز باکتری­های حذف­کننده فسفات متعلق به جنس­های آکروموباکتر[40]، آسینتوباکتر، آگروباکتریم[41]، آلکالیژنز، بروندیموناس و باسیلوس[42] را از فاضلاب کارخانه­ لبنیات در کشور صربستان جدا کردند. در بین این جدایه­ها،  بروندیموناس به­عنوان جدایه برتر در حذف فسفات معرفی شد (16).

کریشناسوامی[43] و همکاران موفق به جداسازی باکتری­های حذف کننده فسفات باسیلوس، سودوموناس، انتروباکتر و اکروموباکترم از پساب سنتتیک تهیه شده به روش آزمایشگاهی شدند (13).

پارک[44] و همکاران  باکتری­هایی از جنس پانتوآ[45]، اوکروباکترم و انتروباکتر[46] را از پساب جدا کردند که اوکروباکترم توانایی بالایی را در حذف فسفات نشان داد (17).

رودریگز[47] و همکاران باکتری اکزیگوباکتریم سیبیریکوم[48] را از فاضلاب صنعتی کارخانه فرآوری سیب­زمینی جدا کردند (18).

مطالعات اخیر با مطالعه ما مطابقت داشت، به طوری که در مطالعه ما سه جنس بروندیموناس، اوکروبکترم و اگزیگوبکتریوم در بین 30 جدایه، جدایه­های برتر بوده و توانایی قابل ملاحظه­ای را در حذف فسفات نشان دادند. اغلب باکتری­های حذف کننده فسفات بنا بر مطالعات محققین اشاره شده، رشد سریع دارند. به طوری که، میزان جذب و حذف فسفات از محیط توسط باکتری­ها با بالا بودن سرعت رشد ارگانیسم در واحد زمان افزایش می­یابد (13).

آن چه مسلم است جمعیت باکتری­ها در فاضلاب­ها و پساب­های مختلف، متفاوت است. این امر، وابسته به نوع پساب، درجه حرارت، اسیدیته، و محل دفع پساب می­باشد (9). مطالعات انجام گرفته مبنی بر جداسازی باکتری­های حذف کننده فسفات نشان داده است که اغلب این باکتری­ها مزوفیل و هوازی هستند (11) که این مساله با جدایه­های باکتریایی در مطالعه ما نیز مطابقت داشت. بیشترین کارایی جدایه­های ما در حذف فسفات در دمای 25 درجه سلسیوس و در شرایط هوازی بود.

فسفات در میکروارگانیسم­ها به دلایلی هم­چون سنتز نوکلییک اسید­ها، فسفولیپیدهای غشایی، سنتز آدنوزین تری فسفات (ATP) و ذخیره­سازی انرژی مورد توجه واقع است (3). به طوری که اهتمام این پژوهش نیز مبنی بر جداسازی باکتری­هایی با عملکرد افزایش بیولوژیکی حذف فسفات در راستای حذف فسفات بود. باکتری­های حذف­کننده فسفات در محیط اختصاصی Seperb جامد که حاوی تری فسفات کلسیم به عنوان منبع فسفات بود، کشت داده شدند و بر اساس توانایی حذف فسفات با ایجاد هاله شفاف در محیط در مدت 10 روز مورد بررسی قرار گرفتند. اندازه قطر هاله ناشی از حذف فسفات توسط باکتری­ها از روز اول تا دهم روند افزایشی داشت. به­طوری که بیشترین فعالیت حذف فسفات در روز دهم مشاهده شد. مکانیسم احتمالی حذف فسفات توسط این باکتری­ها، جذب فسفات در سلول ارگانیسم به صورت گرانول­های پلی­فسفات به عنوان منبع انرژی است که با افزایش زمان تیمار باکتری­ها، جذب فسفات نیز همراه با افزایش تولید توده زیستی[49] افزایش می­یافت (19).

بررسی نتایج آنالیز واریانس در سطح 05/0 نشان داد که بیشترین هاله ایجاد شده در تیمارهای PRP9،PRP11،PRP15   و PRP30 وجود دارد و بین این تیمارها تفاوت معنی­داری از لحاظ آماری مشاهده نشد، ولی با سایر تیمارها از لحاظ آماری تفاوت معنی­داری مشاهده شد.

پیشنهادات

در این پژوهش، باکتری­های حذف کننده فسفات از پساب­های مختلف صنعتی جداسازی و با روش­های بیوشیمیایی و مولکولی تا حد گونه شناسایی شدند. با بررسی­های به عمل آمده، این باکتری­ها توانایی بالایی را در حذف فسفات از پساب دارند. لذا جدایه­های معرفی شده، کاندیدای مناسبی برای زیست­پالایی و زدودن فسفات از پساب هستند. با توجه به وجود صنایع مختلف در کشور و پساب­های دفعی ناشی از آن­ها، جداسازی باکتری­های بومی بیشتر از پساب­های صنایع مختلف و مطالعه میزان حذف فسفات توصیه و پیشنهاد می گردد.

منابع

1-      Usharani, K. and Lakshman aperumalsamy, P., 2010. Bio-treatment of phosphate from synthetic wastewater using Pseudomonas sp YLW-7. Journal of Applied Sciences and Environmental Management, Vol. 14, No. 2, pp. 75-80.

2-      DebRoy, S., S. Das., S. Ghosh., S. Banerjee and D. Chatterjee et al., 2012. Isolation of nitrate and phosphate removing bacteria from various environmental sites. OnLine Journal of Biological Sciences, Vol. 12, No. 2, pp. 62-71.

3-      Van Loosdrecht, M.C.M., C.M. Hooijmans., D. Brdjanovic., J.J. Heijnen., 1997. Biological phosphate removal processes. Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 48, No. 3, pp. 289-296.

4-      Taheriyoun, M., Karamouz, M., and Baghvand, A., 2010. Development of an entropy based fuzzy eutrophication index for reservoir water quality evaluation. Journal of Environmental Health Science and Engineering., Vol. 7, No. 1, pp. 1-14.

5-      Cech, J.S., Hartman, P., 1993. Competition between polyphosphate and polysaccharide accumulating bacteria in enhanced biological phosphate removal systems. Water Research., Vol. 27, No. 7, pp. 1219-1225.

6-      Kulaev, I.S., Vagabov, V.M., Kulakovskaya, T.V., 2004. The biochemistry of inorganic polyphosphates. 2th ed., New York, John Wiley & Sons.

7-      Pasayeva, P., Gezqin, Y., Pekin, G., Eltem, R., 2011. Phosphate uptake performance of bacteria isolated from a full-scale Izmir municipal wastewater treatment plant. Environmental Technology., Vol. 32, No. 5-6, pp. 543-549.

8-      Benammar, L., Menasria, T., Ayachi, A., Benounis, M., 2015. Phosphate removal using aerobic bacterial consortium and pure cultures isolated from activated sludge. Process Safety and Environmental Protection., Vol. 95, No. 1, pp. 237-246.

9-      Eaton, A.D., Clesceri, L.S., Rice, E.W., Greenberg, A.E., editors., 2005. Standard methods for the examination of water and wastewater. 21th ed. Washington, DC: American Public Health Association (APHA)-American Water Works Association (AWWA)-Water Environment Federation (WEF). 1368 p.

10-  Teimouri, M., Korori, S.A.A., Matinizadeh, M., and Khoshnevis, M., 2005. Isolation and identification of phosphate solubilizing bacteria from Vaz forest soil. Pajouhesh & Sazandegi., Vol. 17, No. 65, pp. 57-64. [In Persian].

11-  John, G.H., Noel, R.K., Peter, H.S., James, T.S., Stanley, T.W., 1997. Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology (In Russian). 9th ed. Moscow: Mir Publishers 2.

12-  Sambrook, J., Russell, D., and Irwa, et al., 2001. Molecular Cloning, a Laboratory Manual. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

13-  Krishnaswamy, U., Muthusamy, M., and Perumalsamy, L., 2009. Studies on the Efficiency of the Removal of Phosphate Using Bacterial Consortium for the Biotreatment of Phosphate Wastewater. European Journal of Applied Sciences., Vol. 1, No. 1, pp. 6-15.

14-  Hupfer, M., Gloess, S., Grossart, HP., 2007. Polyphosphate-accumulating microorganisms in aquatic sediments. Aquatic Microbial Ecology., Vol. 47, No. 3, pp. 299-311.

15-  Hupfer, M., Glöss, S., Schmieder, P and Grossart, HP., 2008. Methods for Detection and Quantification of Polyphosphate and Polyphosphate Accumulating Microorganisms in Aquatic Sediments. International Review of Hydrobiology., Vol. 93, No. 1, pp. 1-30.

16-  Brdjanovic, D., Hooijmans C.M., Van Loosdrecht, M.C.M., Alaerts, G.J., and Heijnen, J.J., 1996. The dynamic effects of potassium limitation on biological phosphorus removal. Water Research., Vol.  30, No. 10, pp. 2323-2328.

17-  Park, J., Bolan, N., Megharaj, M., Naidu, R., 2010. Isolation of Phosphate-Solubilizing Bacteria and Characterization of Their Effects on Lead Immobilization. Pedologist, Vol.  53, No. 1, pp: 67-75.

18-  Rodrigues, D.F., Goris, J., Vishnivetskaya, T., Gilichinsky, D., Thomashow, M.F., Tiedje, JM., 2006. Characterization of Exiguobacterium isolates from the Siberian permafrost. Description of Exiguobacterium sibiricum sp. nov. Extremophiles, Vol. 10, No. 4, pp. 286-294.

19-  Sidat, M., Bux, F and Kasan, H.C., 1999. Polyphosphate accumulation by bacteria isolated from activated sludge. Water SA., Vol. 25, No. 2, pp. 175-179.

 

 



1- کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، دانشکده علوم پایه، گروه میکروب­شناسی، سمنان، ایران.

2- دکترای تخصصی میکروبیولوژی، مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی، دانشگاه علوم پزشکی قم، قم، ایران.

3- دانشیار قارچ­شناسی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد گرگان، دانشکده علوم پایه، گروه میکروب­شناسی، گلستان، ایران.

[4]- دانشجوی دکترای تخصصی میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم، دانشکده علوم پایه، گروه میکروب­شناسی، قم، ایران.

[5]*- (مسوول مکاتبات): دکترای تخصصی میکروبیولوژی، گروه میکروب­شناسی، دانشکده علوم پایه،  دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران.

1-            MSc of Microbiology, Department of Microbiology, Faculty of Basic Sciences, Islamic Azad University, Damghan Branch, Semnan, Iran.

2-            PhD Candidate of Microbiology, Cellular and Molecular Research Center, Qom University of Medical Sciences, Qom, Iran.

3-            Associate Professor of Mycology, Department of Microbiology, Faculty of Basic Sciences, Islamic Azad University, Gorgan, Iran.

4-            PhD Candidate of Microbiology, Department of Microbiology, Faculty of Basic Sciences, Islamic Azad University, Qom Branch, Qom, Iran.

5-            PhD Candidate of Microbiology, Department of Microbiology, Faculty of Basic Sciences, Islamic Azad University, Science and Research Branch, Tehran, Iran.* (Corresponding Author)

[11]- Eutrophication

[12]-Enhanced Biological Phosphorus Removal (EBPR)

[13]- Polyphosphate-accumulating organisms (PAOs)

[14]- Poly hydroxyl alkanoates (PHA)

[15]- Acinetobacter

[16]- Pseudomonas

[17]- Burkholderia

8- Brevundimonas

9- Flavobacterium

10- Corynebacterium

11- Pasayeva

12- Pseudomonas aeruginosa

13- Acinetobacter baumannii

14- Izmir

15- Leyla Benammar

16- Acinetobacter junii

17- Alcaligenes denitrificans

18- Moraxella lacunata

19- Bioremediation

[30]- Methyl Red-Voges Proskauer

[31]- Oxidation-Fermentation

3- QIAamp DNA mini kit; Qiagen, Germany

4- Mastercycler® nexus; Eppendorf, Germany

5- MacroGen, Korea- http://www.macrogen.com

1- Blast

2- http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

[37]- Hupfer

[38]- Gloss

[39]- Brdjanovic

[40]- Achromobacter

[41]- Agrobacterium

[42]- Bacillus

[43]- Krishnaswamy

[44]- Park

[45]- Pantoea

[46]- Enterobacter

[47]- Rodrigues

[48]- Exiguobacterium sibiricum

[49]- Biomass

1-      Usharani, K. and Lakshman aperumalsamy, P., 2010. Bio-treatment of phosphate from synthetic wastewater using Pseudomonas sp YLW-7. Journal of Applied Sciences and Environmental Management, Vol. 14, No. 2, pp. 75-80.

2-      DebRoy, S., S. Das., S. Ghosh., S. Banerjee and D. Chatterjee et al., 2012. Isolation of nitrate and phosphate removing bacteria from various environmental sites. OnLine Journal of Biological Sciences, Vol. 12, No. 2, pp. 62-71.

3-      Van Loosdrecht, M.C.M., C.M. Hooijmans., D. Brdjanovic., J.J. Heijnen., 1997. Biological phosphate removal processes. Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 48, No. 3, pp. 289-296.

4-      Taheriyoun, M., Karamouz, M., and Baghvand, A., 2010. Development of an entropy based fuzzy eutrophication index for reservoir water quality evaluation. Journal of Environmental Health Science and Engineering., Vol. 7, No. 1, pp. 1-14.

5-      Cech, J.S., Hartman, P., 1993. Competition between polyphosphate and polysaccharide accumulating bacteria in enhanced biological phosphate removal systems. Water Research., Vol. 27, No. 7, pp. 1219-1225.

6-      Kulaev, I.S., Vagabov, V.M., Kulakovskaya, T.V., 2004. The biochemistry of inorganic polyphosphates. 2th ed., New York, John Wiley & Sons.

7-      Pasayeva, P., Gezqin, Y., Pekin, G., Eltem, R., 2011. Phosphate uptake performance of bacteria isolated from a full-scale Izmir municipal wastewater treatment plant. Environmental Technology., Vol. 32, No. 5-6, pp. 543-549.

8-      Benammar, L., Menasria, T., Ayachi, A., Benounis, M., 2015. Phosphate removal using aerobic bacterial consortium and pure cultures isolated from activated sludge. Process Safety and Environmental Protection., Vol. 95, No. 1, pp. 237-246.

9-      Eaton, A.D., Clesceri, L.S., Rice, E.W., Greenberg, A.E., editors., 2005. Standard methods for the examination of water and wastewater. 21th ed. Washington, DC: American Public Health Association (APHA)-American Water Works Association (AWWA)-Water Environment Federation (WEF). 1368 p.

10-  Teimouri, M., Korori, S.A.A., Matinizadeh, M., and Khoshnevis, M., 2005. Isolation and identification of phosphate solubilizing bacteria from Vaz forest soil. Pajouhesh & Sazandegi., Vol. 17, No. 65, pp. 57-64. [In Persian].

11-  John, G.H., Noel, R.K., Peter, H.S., James, T.S., Stanley, T.W., 1997. Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology (In Russian). 9th ed. Moscow: Mir Publishers 2.

12-  Sambrook, J., Russell, D., and Irwa, et al., 2001. Molecular Cloning, a Laboratory Manual. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

13-  Krishnaswamy, U., Muthusamy, M., and Perumalsamy, L., 2009. Studies on the Efficiency of the Removal of Phosphate Using Bacterial Consortium for the Biotreatment of Phosphate Wastewater. European Journal of Applied Sciences., Vol. 1, No. 1, pp. 6-15.

14-  Hupfer, M., Gloess, S., Grossart, HP., 2007. Polyphosphate-accumulating microorganisms in aquatic sediments. Aquatic Microbial Ecology., Vol. 47, No. 3, pp. 299-311.

15-  Hupfer, M., Glöss, S., Schmieder, P and Grossart, HP., 2008. Methods for Detection and Quantification of Polyphosphate and Polyphosphate Accumulating Microorganisms in Aquatic Sediments. International Review of Hydrobiology., Vol. 93, No. 1, pp. 1-30.

16-  Brdjanovic, D., Hooijmans C.M., Van Loosdrecht, M.C.M., Alaerts, G.J., and Heijnen, J.J., 1996. The dynamic effects of potassium limitation on biological phosphorus removal. Water Research., Vol.  30, No. 10, pp. 2323-2328.

17-  Park, J., Bolan, N., Megharaj, M., Naidu, R., 2010. Isolation of Phosphate-Solubilizing Bacteria and Characterization of Their Effects on Lead Immobilization. Pedologist, Vol.  53, No. 1, pp: 67-75.

18-  Rodrigues, D.F., Goris, J., Vishnivetskaya, T., Gilichinsky, D., Thomashow, M.F., Tiedje, JM., 2006. Characterization of Exiguobacterium isolates from the Siberian permafrost. Description of Exiguobacterium sibiricum sp. nov. Extremophiles, Vol. 10, No. 4, pp. 286-294.

19-  Sidat, M., Bux, F and Kasan, H.C., 1999. Polyphosphate accumulation by bacteria isolated from activated sludge. Water SA., Vol. 25, No. 2, pp. 175-179.