جداسازی، شناسایی و ارزیابی فعالیت اکتینوباکتری های مزارع گندم به منظور کنترل زیستی آفات قارچی

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانش آموخته کارشناسی ارشد مدیریت محیط زیست ، دانشکده مهندسی منابع طبیعی ،دانشگاه آزاد اسلامی، واحد بندرعباس، ایران

2 استادیار، گروه مدیریت محیط زیست ،دانشکده مهندسی منابع طبیعی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد بندرعباس، ایران

3 دکتری تخصصی میکروبیولوژی، بخش بیوتکنولوژی، پژوهشکده اکولوژی خلیج فارس و دریای عمان، موسسه تحقیقات علوم شیلاتی کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی ایران *(مسوول مکاتبات)

4 باشگاه پژوهشگران جوان و نخبگان، واحد تهران شمال ، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

10.22034/jest.2018.13251

چکیده

زمینه و هدف: امروزه آفت‌کش‌ها به‌منظورحفظ امنیت غذایی به‌طورگسترده‌ای درسراسرجهان مورداستفاده قرارمی‌گیرند. به دلیل اثرات نامطلوب و ماندگاری بالا، این ترکیبات ازآلاینده‌های مهم محیط‌زیست محسوب می‌شوند. روش‌های کنترل زیستی آفات به‌عنوان بهترین جایگزین برای آفت‌کش‌های شیمیایی به شمار می‌روند. این مطالعه باهدف جداسازی و شناسایی اکتینوباکتری های مولد ترکیبات ضد قارچی در مقابل قارچ‌هایniger   Aspergillusعامل آفت انباری گندم و Bipolaris sp. عامل پوسیدگی ریشه و طوقه از خاک مزارع گندم منطقه حاجی‌آباد استان هرمزگان انجام گردید.                               
روش­بررسی: در این مطالعه نمونه‌برداری از 3 مزرعه گندم انجام شد. برای جداسازی اکتینوباکتری ها از دو محیط کشت عصاره خاک آگار و نشاسته کازئین آگار استفاده شد. ارزیابی فعالیت ضد قارچی ایزوله ها با روش انتشار از چاهک انجام گردید. شناسایی ایزوله های مولد با استفاده از روشهای مورفولوژیک، بیوشیمیایی، فیزیولوژیک و ژنتیک صورت گرفت.
یافته­ها: در کل حدود 207 ایزوله اکتینوباکتری جداسازی گردید. نتایج بیانگر برتری محیط کشت عصاره خاک آگار با جداسازی 125 ایزوله اکتینوباکتری بود. نتایج تیمار فیزیکی برتری  تیمار حرارتی با جداسازی 85 ایزوله اکتینوباکتری را نشان داد. بدنبال آن تیمار خشک‌کردن و تیمار اشعه فرا بنفش با جداسازی به ترتیب 57 و 44 ایزوله قرار گرفتند. ارزیابی فعالیت ضد قارچی در مورد 100 ایزوله متمایز از لحاظ مورفولوژیک منجر به انتخاب 2 ایزوله فعال در مقابل قارچ‌های بیماریزای  Aspergillus nigerو Bipolaris sp.گردید. شناسایی ایزوله های مولد بر اساس ویژگی‌های مورفولوژیک، بیوشیمیایی و فیزیولوژیک تعلق ایزوله‌های مولد به جنس استرپتومایسس را نشان داد. نتایج حاصل از شناسایی ژنتیکی و تطابق توالی ژن 16s rRNA سویه‌های مولد و آنالیز فیلوژنتیک بیانگر ترادف %99 درصدی سویهStreptomyces sp. -11MG-با Streptomyces albus و ترادف %99 درصدی سویه 21- Streptomyces sp.MGبا griseus  Streptomycesداشت.                                                                                                               
نتیجه­گیری: بر اساس نتایج این پژوهش دو سویه‌ 11- Streptomyces sp. MG و 21- Streptomyces sp. MG به‌عنوان کاندیداهای مناسب به منظور مطالعات کنترل زیستی بیماری‌های قارچی در مزارع گندم پیشنهاد می گردند.
 

کلیدواژه‌ها


 

 

 

 

 

 

 

علوم و تکنولوژی محیط زیست، دورهبیستم، شماره سه ، پاییز 97

                                        

 

جداسازی، شناسایی و ارزیابی فعالیتاکتینوباکتری های مزارع گندم به منظور کنترل زیستی آفات قارچی

 

مجید گذری[1]

ماریا محمدی زاده[2]

محسن گذری[3]*

M_gozari@yahoo.com

مریم رفعتی[4]

 

تاریخ دریافت:17/7/94

تاریخ پذیرش:26/10/94

 

چکیده

زمینه و هدف: امروزه آفت‌کش‌ها به‌منظورحفظ امنیت غذایی به‌طورگسترده‌ای درسراسرجهان مورداستفاده قرارمی‌گیرند. به دلیل اثرات نامطلوب و ماندگاری بالا، این ترکیبات ازآلاینده‌های مهم محیط‌زیست محسوب می‌شوند. روش‌های کنترل زیستی آفات به‌عنوان بهترین جایگزین برای آفت‌کش‌های شیمیایی به شمار می‌روند. این مطالعه باهدف جداسازی و شناسایی اکتینوباکتری های مولد ترکیبات ضد قارچی در مقابل قارچ‌هایniger   Aspergillusعامل آفت انباری گندم و Bipolaris sp. عامل پوسیدگی ریشه و طوقه از خاک مزارع گندم منطقه حاجی‌آباد استان هرمزگان انجام گردید.                               

روش­بررسی: در این مطالعه نمونه‌برداری از 3 مزرعه گندم انجام شد. برای جداسازی اکتینوباکتری ها از دو محیط کشت عصاره خاک آگار و نشاسته کازئین آگار استفاده شد. ارزیابی فعالیت ضد قارچی ایزوله ها با روش انتشار از چاهک انجام گردید. شناسایی ایزوله های مولد با استفاده از روشهای مورفولوژیک، بیوشیمیایی، فیزیولوژیک و ژنتیک صورت گرفت.

یافته­ها: در کل حدود 207 ایزوله اکتینوباکتری جداسازی گردید. نتایج بیانگر برتری محیط کشت عصاره خاک آگار با جداسازی 125 ایزوله اکتینوباکتری بود. نتایج تیمار فیزیکی برتری  تیمار حرارتی با جداسازی 85 ایزوله اکتینوباکتری را نشان داد. بدنبال آن تیمار خشک‌کردن و تیمار اشعه فرا بنفش با جداسازی به ترتیب 57 و 44 ایزوله قرار گرفتند. ارزیابی فعالیت ضد قارچی در مورد 100 ایزوله متمایز از لحاظ مورفولوژیک منجر به انتخاب 2 ایزوله فعال در مقابل قارچ‌های بیماریزای  Aspergillus nigerو Bipolaris sp.گردید. شناسایی ایزوله های مولد بر اساس ویژگی‌های مورفولوژیک، بیوشیمیایی و فیزیولوژیک تعلق ایزوله‌های مولد به جنس استرپتومایسس را نشان داد. نتایج حاصل از شناسایی ژنتیکی و تطابق توالی ژن 16s rRNA سویه‌های مولد و آنالیز فیلوژنتیک بیانگر ترادف %99 درصدی سویهStreptomyces sp. -11MG-با Streptomyces albus و ترادف %99 درصدی سویه 21- Streptomyces sp.MGبا griseus  Streptomycesداشت.                                                                                                               

نتیجه­گیری: بر اساس نتایج این پژوهش دو سویه‌ 11- Streptomyces sp. MG و 21- Streptomyces sp. MG به‌عنوان کاندیداهای مناسب به منظور مطالعات کنترل زیستی بیماری‌های قارچی در مزارع گندم پیشنهاد می گردند.

 

واژه های کلیدی: کنترل زیستی، آفت انباری گندم،پوسیدگی ریشه و طوقه گندم، اکتینوباکتری ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                                                                              

 

 

 

 

J.Env. Sci. Tech., Vol 20, No.3, Autumn, 2018

 

 

 

 


                                                                                                                                                                          

Isolation, identification and evaluation of the Actinobacteria derived from wheat farms to perform biological control of fungal diseases

 

Majid Gozari[5]

Maria Mohammadizadeh[6]

Mohsen Gozari[7] *

M_gozari@yahoo.com

Maryam Rafati [8]

 

Date Received: October 9, 2015

Admission Date:January 16, 2016

 

Abstract

Background and Objective: Nowadays pesticides are extensively used to protect food security worldwide. Due to their undesirable effects, they are considered as important environmental pollutants. Methods for pest biological control are enumerated as an alternative for chemical pesticide. This study was performed to isolate and identify the antifungal-compound-producing Actinobacteria againstAspergillus nigerfungi (stored product pest)and Bipolaris sp.(responsible for root and crown rot disease) from wheat farms of Hajiabad region, Hormozgan province.

Methods: Three farming sites were sampled in this study. Actinobacteria were isolated by soil extract agar and starch casein agar media. Antifungal activities were evaluated by well diffusion agar method. Potent isolates were identified through morphological, physiological, biochemical, and genetic analysis.

Findings: Approximately a total number of 207 Actinobacteria isolates were isolated. From two isolation media, the soil extract agar yielded 125 isolates and exhibited more efficacy. Results of physical treatments showed that heat treatment could isolate 85 colonies and followed by desiccation and UV treatments by 57 and 46 colonies respectively. Evaluation of the antifungal activities of 100 morphologically distinct isolates revealed that only two isolates exhibited antifungal activity against Aspergillus niger and Bipolaris sp. Identification of potent isolates according to morphological, biochemical and physiological properties showed that these isolates belong to Streptomyces genus. Genetically, identification and phylogenetic analysis based on16srRNA gene revealed a high similarity between Streptomyces sp.MG-11and Streptomyces albus (similarity: 99%) and between Streptomyces sp.MG-21 and Streptomyces griseus (similarity: 99%).

Discussion and Conclusions: Results of this study suggest that Streptomyces sp. MG-11 and Streptomyces sp.MG-21can be considered as appropriate candidates for biological control studies against the selected fungal diseases in wheat farms.

 

Keywords: Biological Control, Stored Product Pests, Root and Crown Rot of Wheat, Actinobacteria

 

مقدمه


علیرغم کاربرد گسترده روش‌های کنترل شیمیایی برای مقابله با بیماری‌های قارچی در کشاورزی، اثرات نامطلوب آن‌ها مانند بروز مقاومت به قارچ‌کش‌های شیمیایی و آلودگی محیط‌زیست توجه روزافزونی را به استفاده از راهکار مبارزه بیولوژیک معطوف نموده است(1). اﺳﺘﻔﺎده بی‌رویه از آفت‌کش‌ها درﻛﺸﺎورزی ﺑﺪون ﺗﻮﺟﻪ ﺑﻪ مخاطرات زیست‌محیطی سبب آﻟﻮدﮔﻲ محیط‌زیست به ‌ویژه ﻣﻨﺎﺑﻊآﺑﻲمی‌گردد. پساب‌هایﻛﺸﺎورزی ازﻣﻀﺮﺗﺮﻳﻦ ﻣﻨﺎﺑﻊآلاینده محیط‌زیست می‌باشند(2) اثرات مخرب و شدید آفت‌کش‌های شیمیایی‌برمحیط‌زیست از قبیل کاهش تنوع زیستی اکوسیستم‌ها،درخطر قرار دادن گونه‌های در معرض انقراض و اثرات کشنده بر حیات‌وحش و پرندگان،به کارگیری آن‌ها را مخاطره‌آمیزمی‌سازد(3). مطالعات اخیر بیانگر قرارگیری 62 گونه پرنده درخطر انقراض به دلیل استفاده از آفت‌کش‌ها در کشور کانادا و نیز کاهش 4 درصدی پرندگان زمین‌های کشاورزی در امریکا می‌باشد(4). فرآورده‌های کنترل زیستی عملکرد موفقیت‌آمیزی در راستای حفاظت از اکوسیستم‌های طبیعی و توسعه برنامه‌های بازسازی محیط‌زیست در سراسر جهان ایفا می‌کنند(5). از میان روش‌های کنترل زیستی آفات، عوامل کنترل میکروبی با کاربردی مشابه آفت‌کش‌های شیمیایی از بهترین جایگزین‌ها می‌باشند. کنترل میکروبی آفات در کشورهای در حال‌توسعه اهمیت روزافزونی یافته است(6). قارچ Aspergillus niger یکی ازآفات انباری گندم می‌باشد.این قارچ با رشد روی گندم سم اکراتوکسینA را تولید می‌نماید که به‌عنوان آلاینده دانه‌های حبوبات وغلات مانندگندم و جوشناخته‌شده و در مهره‌داران وگیاهان مسمومیت حاد ایجاد می‌نماید(7). قارچBipolaris sp.  عامل بیماری پوسیدگی ریشه و طوقه گندم می‌باشد. خسارت این بیماری درکشورهای مختلف متغیرگزارش‌شده است. در برزیل 9 تا 23 درصد(8) ،دراسترالیا 6 تا44 درصد (9) و درکانادا 30تا35 درصد(10)، خسارت ایجاد نموده است. درایران خسارت سالیانه بیماری پوسیدگی ریشه گندم3 تا 5/12 درصد گزارش‌شده است (11). اساس رسیدن به توسعه عوامل کنترل میکروبی آفات، جداسازی و شناسایی سویه‌های مؤثر و مناسب در مقابل آفات است (12). در این زمینه اکتینوباکتری ها به‌عنوان بخش مهمی از فلور میکروبی خاک و رسوبات دریایی در زمینه های مختلف مورد مطالعه قرارگرفته‌اند (14،13). این باکتری‌ها با مکانیسم های مختلف از قبیل تولید آنتی‌بیوتیک نقش مهمی را در میان­کنش‌های رقابتی و کنترل قارچ‌های بیماری­زای خاک زاد ایفا می‌ نمایند(15). در یک پژوهشWan و همکارانش در سال  2008 یک ترکیب ضد قارچی فرار را ازباکتریplatensis Streptomyces تولید نمودند(16). Coombsو همکارانش در سال 2004 بیان کردند که اکتینوباکتری­های اندوفیت دارای قابلیت کنترل زیستی بیماری‌های قارچی گندم می‌باشند (17).  Doohanوkhan  در سال 2009 موفق شدند با استفاده ازباکتری‌هایPseudomonas fluorescens  سویه‌های 249Mkb،  158  Mkbو frederiksbergensis  Pseudomonas سویه 202، شدت علایم بیماری فوزاریوم سنبله گندم که توسط قارچ Fusarium culmorum در گندم و جو ایجاد شده بود را کاهش دهند. این مطالعه با هدف جداسازی و شناسایی قابلیت کنترل زیستی اکتینوباکتری­های موجود در خاک‌های مزارع گندم منطقه حاجی‌آباد استان هرمزگان به ‌منظور مقابله با قارچ‌هایA. niger و Bipolaris sp. انجام گردید (18)

 

مواد و روش‌ها

1- میکروارگانیسم‌های مورداستفاده درتحقیق: در این پژوهش سویه‌های قارچی 5057 PTCC[9] :  A. nigerعامل بیماری آفت انباری گندم و 5225 PTCC   :  Bipolaris sp. مورداستفاده قرارگرفتند.

2- نمونه‌برداری

ازبین سایت‌های کشت گندم منطقه حاجی‌آباداستان هرمزگان سه سایت و درهرسایت 5 ایستگاه انتخاب شد ونمونه خاک با استفاده از مدل زیگزاگی و به‌صورت تصادفی جمع‌آوری گردید( 19). نمونه‌های خاک از بخش‌های مختلف خاک شامل ریزوسفر و عمق0 تا 30 سانتی‌متری از سطح خاک جمع‌آوری ‌و پس از انتقال به ظروف شیشه‌ای استریل به ﺁزمایشگاه منتقل شدند.

3- جداسازی و خالص‌سازی اکتینوباکتری­ها

برای افزایش جداسازی اکتینوباکتری­ها پیش تیمارهای فیزیکی مختلف شامل تیمارهای حرارتی، خشک‌کردن در هواو تیمار پرتو فرابنفش بر روی نمونه‌ها انجام شد.نمونه‌های تیمار شده با استفاده از روش رقت متوالی تا رقت 001/0رقیق‌سازی و با روش پخش کردن در سطح محیط‌های کشت نشاسته کازیین آگار وعصاره خاک آگار به میزانμl200 کشت داده شدند. محیط‌های کشت تلقیح شده به مدت 4 هفته در دمای C°28  درجه سانتی‌گراد گرماگذاری گردیدند(20).

4-  بررسیفعالیتضدقارچیجدایههایاکتینوباکتری

فعالیت جدایه های خالص‌شده اکتینوباکتری­ها علیه قارچ‌هایA. niger و Bipolaris sp. با استفاده از روش انتشار از چاهک مورد بررسی قرار گرفت. از محیط کشت‌های )HTB[10] بر اساس فرمول  (DSMZ[11] و[12] ISPII (تهیه شده از شرکت Hi media) برای ارزیابی تولید ترکیب ضدمیکروبی توسط ایزوله‌های اکتینوباکتری استفاده شد. به هرکدام از محیط‌های کشت سوسپانسیون اسپوری با رقت 107 بر میلی‌لیتر به میزان 5 درصد حجم محیط کشت تلقیح گردید. سپس محیط‌های تلقیح شده در انکوباتور شیکردار در دمای C°28 به مدت 5 روز با دور220 دور بر دقیقه گرماگذاری گردیدند. پس از اتمام دوره گرماگذاری، نمونه‌گیری از محیط‌های کشت حاوی باکتری انجام شد. نمونه‌ها به درون میکروتیوب ریخته شدند و پس از سانتریفیوژ با دورg 4000 به مدت20دقیقه مایع رویی برداشته شد. 100 میکرولیتر از مایع رویی هر یک از ایزوله‌ها به درون چاهک‌های تعبیه‌شده (به قطر mm4) در محیط سیب زمینی دکستروز آگار تلقیح شده با قارچ بیماری­زای موردنظر با حجم 25 میلی‌لیتر اضافه گردید و قطر هاله ممانعت از رشد ایجادشده پس از 4 روز مورد بررسی قرار گرفت(21).

5- شناسایی سویه‌های مولدترکیبات ضد قارچی

خصوصیات مورفولوژیک سویه‌ها با استفاده از تصاویر میکروسکوپی بررسی گردید(22). خصوصیات بیوشیمیایی ایزوله‌های مولد منتخب با استفاده از محیط‌های کشت های ISP از نظر مصرف منابع مختلف کربن و نیتروژن و نیز خصوصیات فیزیولوژیک از قبیل تولید آنزیم های مختلف مورد بررسی قرار گرفتند(23). به‌منظور شناسایی ژنتیکی سویه‌ها با DNA آن‌ها با استفاده از روش CTAB استخراج گردید. به دنبال آن ژن 16srRNAسویه‌ها با استفاده ازپرایمر هایf9و R 1541تکثیرشده و بعد از خالص‌سازی به ‌منظور تعیین توالی به همراه 5 µl پرایمر (برای هر نمونه)، به شرکت Promega ارسال شد. پس از تعیین توالی نوکلئوتیدی ژن16srRNA مربوط به ایزوله‌های موردنظر، توالی‌های به‌دست‌آمده با توالی‌های موجود در بانک ژن مورد آنالیز قرار گرفت (24).

6- آنالیز فیلوژنتیک و ثبت ژن

به منظور اطمینان از صحت تعیین توالی ژن16s rRNA سویه‌های منتخب از  نرم افزار DNA base 4.10  استفاده شد. به دنبال آن توالی های آنالیز شده در مقابل توالی‌های ژن16s rRNA  سایر گونه‌های موجود در بانک ژن NCBI بوسیله  نرم افزار  Megablast مورد مطابقت قرار گرفت. ثبت ژن توالی های بدست آمده بوسیله نرم‌افزار Banklt در بانک ژنNCBI انجام شد و پس از اعتبار سنجی از سوی NCBI  توالی های مورد نظر با شماره‌های دستیابی KJ028023 و  KJ028024ثبت گردید. آنالیز فیلوژنتیک سویه های منتخب با استفاده از نرم افزار MEGA6 انجام شد.

نتایج

1- جداسازی اکتینوباکتری­ها از نمونه‌های جمع‌آوری‌شده

به دنبال مرحله جداسازی با استفاده از 2 محیط کشت جداسازی مختلف حدود 207 جدایه اکتینوباکتری بدست آمد. محیط کشت عصاره خاک آگار با جداسازی 125 کلونی اکتینوباکتری بیشترین تعداد کلونی جداشده را به خود اختصاص داد و به دنبال آن محیط کشت نشاسته کازیین آگار 82 جدایه اکتینوباکتری را جدا نمود(شکل 1).

 

 

شکل1- جداسازی اکتینوباکتریها در دو محیط کشت مختلف

Figure1. Isolation of actinobacteria in two different culture media

 

 


 

 

2- بررسی اثر تیمارهای انجام‌شده بر جداسازی اکتینوباکتری­ها

تیمار حرارتی با جداسازی 85 جدایه اکتینوباکتری به‌عنوان بهترین تیمار ارزیابی شد و پس‌ازآن به ترتیب تیمار خشک‌کردن با جداسازی 57 جدایه و تیمار پرتوفرابنفش با جداسازی 44 جدایه قرار گرفتند. هم چنین از نمونه بدون تیمار نیز کشت شد که درمجموع 21 کلونی جداسازی گردید(شکل ۲).

 

 

شکل2-تأثیر تیمارهای فیزیکی بر جداسازی اکتینوباکتری­ها در محیط‌های کشت مختلف

Figure 2. Effect of physical treatment on isolation of actinobacteria in different culture media

 

 

3- ارزیابی فعالیت ضد قارچی اکتینوباکتری های جداشده در مقابلA. nigerوBipolaris sp.

مقایسه تولید ترکیبات ضدقارچی در 2 محیط کشت مایع HTBوISP II broth  پس از مدت 5 روز از کشت باکتری بیانگر تولید میزان بیشتر ترکیبات ضد قارچی در محیط HTB بود. (جدول ۱، شکل 3).

 

 

جدول1- ارزیابی فعالیت ضد قارچی اکتینوباکتری­های جداشده

Table 1. Evaluation of antifungal activity of isolated actinobacteria

شماره ایزوله

محیط کشت

قطر هاله ممانعت از رشد(mm)

A. niger

Bipolaris sp.

MG-11

HTB

12

15

ISP II

-

10

MG-21

HTB

 

ISP II

12

 

-

14

 

-

    

 

 

 

 

 

 

 الف A

 ب

شکل 3- ارزیابی فعالیت ضد قارچی سویه های مولد پس از 4 روز از کشت قارچ  الف.   MG- 11 ب.MG- 21

Figure 3. Evaluation of antifungal activity of putative strains after 4 days.  A. MG-11 B. MG-21

 

 

4- شناسایی اکتینوباکتری­های مولد ترکیب ضد قارچی

 

شناسایی مورفولوژیک اکتینوباکتری­های مولد جداشده شامل شکل ماکروسکوپی و میکروسکوپی، رنگ مسیلیوم های رویشی و هوایی و خصوصیات رشدی شامل میزان رشد و تولید اسپور در محیط‌های مختلف ویژگی‌های مورفولوژیک و جدایه های مولد MG-11وMG-21 به ترتیب درشکل(2)، جدول(2و 3) نشان داده شد. خصوصیات بیوشیمیایی و فیزیولوژیک جدایه های مولد از قبیل مصرف منابع کربن و نیتروژن و تولید آنزیم‌های مختلف مورد بررسی قرار گرفت(جدول 4). این نتایج تعلق سویه‌های مولد به جنس Streptomyces را نشان داد.
شناسایی ژنتیکی سویه‌های مولد پس از استخراج DNA ژنومی وتکثیر ژن16s rRNA سویه‌های مولدمنجر به تولید محصولی با وزنbp1500 گردید (شکل 5). نتایج حاصل ازتطابق توالی بدست آمده از سویه‌های مولد با سویه‌های موجود در بانک اطلاعاتی نوکلئوتیدها درNCBI[13] بیانگر همولوژی 99 درصدی سویه‌هایMG-11 باStreptomyces albus  و MG-21 با  Streptomyces griseus بود.

 


    

الف

 

ب

 

  

شکل 4- ویژگی­های ماکروسکوپی و میکروسکوپی سویه های مولد الف. MG- 11  ب. MG- 21

Figure 4. Macroscopic and Microscopic features of putative strains A. MG-11  B. MG-21

 

جدول2- شناسایی بیوشیمیایی و فیزیولوژیک سویه های مولد

Table 2. Biochemical and physiological identification of potent strains

Utilization of

MG-11

MG-21

Enzyme

MG-11

MG-21

glucose

+

+

Gelatin

+

+

Fructose

-

+

Citrate

+

-

Xylose

-

+

Urease

+

-

Arabinose

-

+

Arginine

+

+

Rhamnose

-

-

VP

+

+

Sucrose

+

-

Indol

-

-

Raffinose

-

-

H2S

-

-

Mannose

-

-

Hemolysis

-

-

Maltose

+

+

 

 

 

 

 

 

جدول 3- رنگ میسلیوم های هوایی و رویشی سویه های  مولددر محیط‌های مختلف

Table 3. color of aerial and vegetative mycelium of putative strains in different culture media

محیط کشت

رنگ میسلیوم

ISP II

ISP III

ISP IV

ISP V

MG-11

رویشی

زرد

زرد

کرم

کرم

هوایی

خاکستری

زرد

کرم

زرد

MG-21

رویشی

زرد

زرد

زرد

زرد

هوایی

سفید

سفید

سفید

سفید

جدول 4- ویژگی‌های رشدی سویه های  مولد در محیط‌های مختلف

Table 4. Growth features of putative strains in different culture media

MG-21

MG-11

مشخصه

 

G

G

رشد

ISP II

G

G

تولید اسپور

I

I

رشد

ISP III

I

I

تولید اسپور

I

G

رشد

ISP IV

I

I

تولید اسپور

I

I

رشد

ISP V

I

I

تولید اسپور

I

I

رشد

ISP VI

N

N

تولید اسپور

I

I

رشد

ISP VII

N

I

تولید اسپور

I

I

رشد

CDA

I

G

تولید اسپور

G

G

رشد

BA

G

G

تولید اسپور

I

G

رشد

NA

N

N

تولید اسپور

G: رشد یا تولید اسپور خوب    I: رشد یا تولید اسپورمتوسط    N: بدون رشد یا تولید اسپور

 

 

شکل 5- الکترفورز ژن16s rRNAتکثیرشده در واکنش PCR برای سویه‌های مولد ترکیب ضد قارچی. درچاهک اول(سمت چپ ژل)نشان گر وزنی100bpDNA Ladderبارگذاری شده است.

Figure 5. 16s rRNA gene electrophoresis amplified in PCR reaction from antifungal producing strains. First well was loaded by 100bpDNA Ladder

           


5- آنالیز فیلوژنتیک سویه‌های مولد ترکیب ضد قارچی

آنالیز فیلوژنتیک توالی ژن 16s rRNAسویه‌های مولد جداشده با نزدیک‌ترین سویه‌ها شناسایی‌شده با استفاده از نرم‌افزار MEGA 6 بیانگر قرارگیری سویه‌هایMG-11 با Streptomyces albus و -21 MG با Streptomyces griseus در دو خوشه جداگانه بود(شکل 6).


 

 

شکل 6. آنالیز فیلوژنتیک سویه‌های مولد ترکیب ضد قارچی

Figure 6. Phylogenetic analysis of antifungal producing strains

 

 

 

 

 

بحث و نتیجه‌گیری


امروزه یافتن سویه‌های بومی مولد ترکیبات ضد میکروبی به منظور کنترل زیستی آفات کشاورزی مورد توجه قرارگرفته و نمونه‌های تجاری‌سازی شده آن­ها به ‌عنوان ابزاری جدید در خدمت مدیریت محیط زیستی آفات در بازار موجود می‌باشد (25). در این مطالعه به منظور دستیابی به سویه های بومی کنترل کننده آفات قارچی مورد نظر نمونه برداری از خاک مزارع گندم انجام شد. استفاده از سویه های بومی کارایی میدانی فرآیند کنترل زیستی را ارتقا بخشیده و شانس یافتن گزینه های موفق را افزایش می­دهد. براساس نتایج ارایه ‌شده بیشترین کلونی اکتینوباکتری با استفاده از محیط کشت عصاره خاک آگار بدست آمد. پس ‌از آن محیط کشت نشاسته کازیین آگار تعداد 85 جدایه را جداسازی نمود. این تفاوت در میزان جداسازی اکتینوباکتری­ها به دلیل فرمولاسیون محیط کشت عصاره خاک آگار است که دارای ترکیبات مشابه خاک می‌باشد. درحالی‌که محیط کشت نشاسته کازیین آگار دارای منبع کربن نشاسته بوده که یک هیدروکربن به نسبت پیچیده است و میکروارگانیسم‌های دارای آنزیم آمیلاز می‌توانند آن را مصرف کنند. منبع نیتروژن این محیط کشت نیترات پتاسیم و کازئین است که نیازهای یک میکروارگانیسم را برطرف می‌کنند(26). در همین راستا  Hamakiو همکاران در سال 2005 گزارش نمودند که محیط کشت عصاره خاک آگار به‌عنوان محیط مناسبی برای جداسازی اکتینوباکتری­های جدید می‌باشد. آن‌ها موفق به جداسازی گونه‌های جدید اکتینوباکتری­های Bradyrhizobium گردیدند(27). در زمینه استفاده از تیمارهای حرارتی و نقش آنها در افزایش کارایی جداسازی گونه های اکتینوباکتری­ها مطالعات متعددی انجام شده است(28). در مطالعه حاضر تیمار حرارتی با جداسازی 85 جدایه اکتینوباکتری بهترین نتیجه را ارایه نمود و سپس تیمار خشک‌کردن با 57 جدایه و تیمار پرتو فرابنفش با جداسازی 44 جدایه در رده‌های بعدی قرار گرفتند. کارایی جداسازی تیمار حرارتی احتمالاً به دلیل حذف قارچ‌های مزوفیل افزایش یافت. رشد نسبتا سریع­تر قارچ های مزوفیل در محیط کشت جداسازی باعث آلودگی و نیز کمبود مواد مغذی مورد نیاز برای رشد اکتینوباکتری­ها شد. تیمار خشک‌کردن عموماً باکتری‌های گرم منفی را از بین برد و پرتو فرابنفش باکتری‌های حساس به UV را حذف نمود(29). در کل حدود 207 جدایه بدست آمد که با توجه به مطالعات مرفولوژیک تعداد 100 جدایه متمایز برای ارزیابی فعالیت ضد قارچی انتخاب گردید. مقایسه تولید ترکیبات ضد قارچی در 2 محیط کشت مایع HTBو ISP II broth  بیانگر میزان تولید بیشتر جدایه های مولد در محیط HTB داشت. این نتیجه می‌تواند به دلیل استفاده از عناصر کمیاب مانند کلرید کبالت و محتوای پروتئین بالاتر محیط HTB نسبت بهISPII باشد زیرا کبالت بخشی از ساختار ویتامین B12 است که به‌عنوان یک کوآنزیم نقش مهمی در فرایندهای متیلاسیون و واکنش‌های بازآرایی اسکلت کربن آنتی‌بیوتیک‌ها دارد(30). با توجه به نتایج، آنتی‌بیوتیک تولیدشده توسط سویه‌هایStreptomyces sp. MG-11 و MG-21 Streptomyces sp. تأثیر بیشتری بر قارچ Bipolaris sp. نسبت بهA. niger  داشت. این اثر می‌تواند به علت تفاوت الگوی حساسیت به آنتی‌بیوتیک به دلیل تفاوت های ساختاری و فیزیولوژیک قارچ‌های مورد بررسی ‌باشد. در همین زمینه Compant و همکاران نشان دادند سویه‌هایStreptomyces با تولید آنزیم β-1 و 3-گلوکاناز دیواره سلولی قارچ پاتوژنF. oxysporum را تجزیه می‌نماید و اثر کنترلی خود را ایفا می‌کند(31).در مطالعه دیگری Shimizuو همکارانش گزارش دادند از میان 178 ایزوله اکتینوباکتری 11 سویه قادر به تولید ترکیبات ضد قارچی در مقابل قارچ  Colletotrichumعامل آنتراکنوز خیار بودند (32).  شناسایی جدایه های مولد در مطالعه حاضر با استفاده از روش‌های چند مرحله‌ای شامل مطالعات میکروسکوپی و ماکروسکوپی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیک بیانگر تعلق باکتری‌های جداشده به جنس  Streptomycesبود. شناسایی ژنتیکی سویه‌های جداشده با روش تکثیر ژن 16s rRNA نشان دهنده ترادف 99 درصد سویه  Streptomyces sp.MG-11با باکتری S. album و ترادف 99 درصدی سویه-21 Streptomyces sp.MG با باکتری S. griseus بود. در این زمینه Someya و همکاران در مطالعه ای فعالیت ضد قارچی یک سویه کاندیدای کنترل زیستی را در مقابل قارچ های بیماریزای  R. solani و  F. oxysporum نشان دادند. نتایج آزمون های شناسایی نشان داد این سویه به گونه Serratia marcescens تعلق داشت(33). در مطالعه دیگری Amein  و همکارانش در سال 2008 یک سویهباکتری بومی Pseudomonas fluorescens را شناسایی نمودند که در شرایط میدانی به طور قابل ملاحظه ای موجب رشد و افزایش محصول گندم گردید. (34). آنالیز فیلوژنتیک سویه‌های مولد ترکیب ضد قارچی و مقایسه آن‌ها با سایر سویه‌های مطالعه شده نشان داد که سویهStreptomyces sp.MG-11 با سویه Streptomyces spectabilis CMU-PA101کهاز گونهپاندانوس از تایلند جداشده بود در یک خوشه قرار می‌گیرد (35). سویهStreptomyces sp.MG-21 ازلحاظ تکاملی زودتر از سایر گونه‌های مورد بررسی انشقاق یافته است. در این پژوهش قابلیت کنترل زیستی دو سویه Streptomyces‌ جداشده از مزارع گندم استان هرمزگان در فاز آزمایشگاهی تأیید گردیدکه می‌تواند گامی مؤثر در جهت دستیابی به سویه‌های کنترل‌کننده بیماری‌های قارچی با قابلیت تجاری‌سازی باشد. با توجه به بومی بودن سویه‌های Streptomyces sp.MG-11 و-21Streptomyces sp.MG سازش‌های اکولوژیک را با محیط خود یافته‌اند و بهترین گزینه برای مدیریت محیط زیستی بیماری‌های قارچی گندم در منطقه می‌باشند. به‌کارگیری نتایج حاصل از این تحقیق می‌تواند استراتژی جدیدی برای کاهش مصرف سموم و آلاینده‌های شیمیایی در مزارع گندم و درنتیجه کاهش آلودگی‌های محیط‌زیست را مطرح نماید و ابزاری جدید در جهت کنترل زیستی در اختیار برنامه‌های مدیریت تلفیقی آفات به‌عنوان بخشی از مدیریت محیط‌زیست قرار دهد.

 

 

 

Reference

  1. Council, E.S.R., 2008. Biological Alternatives to Chemical Pesticides. Science Daily. In http://www.sciencedaily.com/releases/2008/10/081008065841.htm.
  2. Braden, J.B. and J.S. Shortle, 2013. “Agricultural Sources of Water Pollution,” In Encyclopedia of Energy, Natural Resource and Environmental Economics, Ed. J. Shogren, Chap. 111. Elsevier, Amsterdam. pp.81-85.
  3. Wasim Aktar, Md., Sengupta, Dwaipayan., Chowdhury Ashim., 2009. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards.  Interdisciplinary Toxicology.2 (1): 1–12.
  4. Weber, C., 2008.For the Consideration of Biodiversity in Plant Protection Legislation. pp. 15.
  5. Van Driesche, R.G, Carruthers, R.I, Center, T., Hoddle, M.S., Hough-Goldstein, J,. Morin, L. Smith, L,. Wagner, D.L., Blossey, B., et al.2010. Classical biological control for the protection of natural ecosystems. PSIS/Entomology, University of Massachusetts, Fernald Hall, Amherst, MA 01003, USA. Biological Control54 .2010. S2–S33.
  6. El-Bendary, M.A., 2006. Bacillus thuringiensis and Bacillus sphaericus biopesticides production. Journal of Basic Microbiology. 46, 158–170.
  7. EPA, 1997. Aspergillus niger Final Assessment, Risk, see information in:http: www.epa.gov/biotech_rule/pubs/fra/fra006.htm.extension systems.39 5.
  8. Diehl Y.A., Tinline R.D., Kochhann R.A., Shipton P.Y., and Rovira A.D. 1982. The effect of fallow periodson common root rot of wheat in Rio Grande do sul, Brazil. Phytopathology. 72: 1279-1301.
  9. Piccinni G., Shriver J.M., and Rush C.M. 2001. Relationship among seed size, planting date, and common root rot in hard red winter wheat. Plant Dis. 85: 973-976.
  10. Ledingham. R. J, Atkinson. T.G.: Horricks. J.S.: Mills. J. T, Pienini. LJ and Tinline.R.D., 1973. Wheat losses due to common root rot in the Prairie provinces of Canada. 1 969-7 1. Can. Plant Dis. Surv. 53: 1 1 3-22.
  11. Mansouri, B. 2003, Damage due to Karnal bunt disease in wheat commercial
    varieties, 23rd Iranian Plant Protection Congress, Razi University, Kermanshah, Iran. (In Persian)
  12. Berdy, J .2005, Bioactive Microbial metabolite, Journal of Antibiotics,58:493-496.
  13. Gozari M, Mortazavi M, Bahador N, Tamadoni Jahromi S, Rabbaniha M. Isolation and screening of antibacterial and enzyme producing marine actinobacteria to approach probiotics against some pathogenic vibrios in shrimp Litopenaeus vannamei. IJFS. 2016; 15 (2):630-644.
  14. Gozari M, Mortazavi M, Karimzadeh R, Ebrahimi M, Dehghani R. Isolation, Identification and Evaluation of antimicrobial activity of Actinomycetes from marine sediments of Persian Gulf (Hormozgan Province). ISFJ. 2017; 25 (1):81-93.
  15. Iznaga, Y., Lemus, M., González, L., Garmendía, L., Nadal, L. and Vallín, C. 2004. Antifungal activity of actinomycetes from cuban soils. Phytotherapy Research., 18, 494-496.
  16. Wan, M.G., Li, G.Q., Zhang, J.B., Jiang, D.H., Huang, H.C., 2008. Effect of volatile substances of Streptomyces platensis F-1 on control of plant fungal diseases. Biological Control 46, 552–559.
  17. Coombs JT, Michelsen PP, Franco CMM, 2004. Evaluation of entophytic actinobacteria as antagonists of Gaeumannomyces graminis var. tritici in wheat. Biological control 29:359–366.
  18. Khan M. R,. Doohan. F. M. 2009. Bacterium-mediated control of Fusarium head blight disease ofwheat and barley and associated mycotoxin contamination of grain, University College Dublin, Belfield, Biological Control 48 .42–47.
  19. Carter M.R., Gregorich E.G,2008. Soil Sampling and Methods of Analysis. CRC Press Taylor & Francis Group.34p
  20. .Hayakawa M, Sadakata T†, Kajiura T, Nonomura H, 1991. New methods for the highly selective isolation of Micromonospora and Microbispora from soil, Journal of Fermentation and Bioengineering 72: 5, 320–326.
  21. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K.-H., Stackebrandt, E. (Eds.), 2006. The Prokaryotes, vol.3. Springer, New York, pp. 652–668.
  22. Shirling, E. B. & Gottlieb, D., 1966. Methods for characterization of Streptomyces species.
    International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology16, 313–340.
  23. Williams, S. T. Goodfellow, M. Alderson, G. Wellington, E. M. H. Sneath, P. H. A. and Sackin, M. J.,1983. Numerical classification of Streptomyces and related genera. Journal of general microbiology, 129, 1743–1813.
  24. Kieser, T, Bibb, M.J., Buttner, M.J., Chater, K.F., and Hopwood, D.A, 2000. Practical Streptomyces Genetics. Norwich: The John Innes Foundation.
  25.  Fravel, D.R., 2005. Commercialization and implementation of biocontrol. Annual. Rev. Phytopathology. 43, 337–359.
  26. Moat, Albert G., John W. Foster, and Michael P. 2003.Spector, eds. Microbial physiology. Wiley. Com.
  27. Hamaki, T.,Suzuki M, fudou R, jojima Y, kajiura T, tabuchi A, sen Kand shibai H, 2005. Isolation of novel bacteria and actinomycetes using Soil Axtract Agar medium, Journal of Bioscience and Bioengineering, 99, 5: 485-492.
  28. Goodfellow M2010. Selective Isolation of Actinobacteria, In Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, Third Edition. ASM Press, Washington, DC, p 13-27.
  29. Hayakawa M, Sadakata T†, Kajiura T, Nonomura H, 1991. New methods for the highly selective isolation of Micromonospora and Microbispora from soil, Journal of Fermentation and Bioengineering 72: 5, 320–326
  30. Tsueng G, Sing Lam K, 2009. Effect of cobalt and vitamin B12 on the production of salinosporamides by Salinispora tropica. The Journal of antibiotics, Tokyo. Apr;62(4):213-6.
  31. Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clément, C. and Ait Barka, E, 2005. Useof plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects. Applied and Environmental Microbiology. 71:4951–4959.
  32. Masafumi, Shimizu., Sachiko, Yazawa., Yusuke, Ushijima., 2009, A promising strain of endophytic Streptomyces sp. for biological control of cucumber anthracnose, The Phytopathological Society of Japan and Springer, J Gen Plant Pathol ,75:27–36.
  33.  Someya N, Kataoka N, Komagata T, Hirayae K, Hibi T, Akutsu K., 2000.Biological control of cyclamen soilborme disedses by Serratia marcescens strain B2. Plant Dis 84:334–340.
  34. Amein T, Omer Z, Welch C., 2008. Application and evaluation of Pseudomonas strains for biocontrol of wheat seedling blight. Crop Prot 27:532–536
  35. Khamna S, Yokaota A, Peberdy FJ, Aiumyong S., 2009. Antifungal activity of Streptomyces spp. isolated from rhizosphere of Thai medicinal plants. International Journal of Integrative Biology; 6:143-147

 

 



1- دانش آموخته کارشناسی ارشد مدیریت محیط زیست ، دانشکده مهندسی منابع طبیعی ،دانشگاه آزاد اسلامی، واحد بندرعباس، ایران

2- استادیار، گروه مدیریت محیط زیست ،دانشکده مهندسی منابع طبیعی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد بندرعباس، ایران

3- دکتری تخصصی میکروبیولوژی، بخش بیوتکنولوژی، پژوهشکده اکولوژی خلیج فارس و دریای عمان، موسسه تحقیقات علوم شیلاتی کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی ایران *(مسوول مکاتبات)

4- باشگاه پژوهشگران جوان و نخبگان، واحد تهران شمال ، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

1- M.Sc. in Environmental Management, Department of Environmental Management, Bandar Abbas Branch, Islamic Azad University, Bandar Abbas, Iran

2- Assistant Professor, Department of Environmental Management, Bandar Abbas Branch, Islamic Azad University, Bandar Abbas, Iran

3- Department Biotechnology, Persian Gulf and Oman Sea Ecological Research Institute, Iranian Fisheries Research Organization, Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO)-Bandar Abbas- Iran* (Corresponding Author)

4- Young Researchers and Elite Club, North Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

1. Persian Type Culture Collection

1- HickeyTresner broth

2- German Collection of Microorganisms and Cell Culture

3- International Streptomyces Project II

1- National Center for Biotechnology Information

 

 

 

علوم و تکنولوژی محیط زیست، دورهبیستم، شماره سه ، پاییز 97

                                                                

 

جداسازی، شناسایی و ارزیابی فعالیتاکتینوباکتری های مزارع گندم به منظور کنترل زیستی آفات قارچی

 

مجید گذری[1]

ماریا محمدی زاده[2]

محسن گذری[3]*

M_gozari@yahoo.com

مریم رفعتی[4]

 

تاریخ دریافت:17/7/94

تاریخ پذیرش:26/10/94

 

چکیده

زمینه و هدف: امروزه آفت‌کش‌ها به‌منظورحفظ امنیت غذایی به‌طورگسترده‌ای درسراسرجهان مورداستفاده قرارمی‌گیرند. به دلیل اثرات نامطلوب و ماندگاری بالا، این ترکیبات ازآلاینده‌های مهم محیط‌زیست محسوب می‌شوند. روش‌های کنترل زیستی آفات به‌عنوان بهترین جایگزین برای آفت‌کش‌های شیمیایی به شمار می‌روند. این مطالعه باهدف جداسازی و شناسایی اکتینوباکتری های مولد ترکیبات ضد قارچی در مقابل قارچ‌هایniger   Aspergillusعامل آفت انباری گندم و Bipolaris sp. عامل پوسیدگی ریشه و طوقه از خاک مزارع گندم منطقه حاجی‌آباد استان هرمزگان انجام گردید.                               

روش­بررسی: در این مطالعه نمونه‌برداری از 3 مزرعه گندم انجام شد. برای جداسازی اکتینوباکتری ها از دو محیط کشت عصاره خاک آگار و نشاسته کازئین آگار استفاده شد. ارزیابی فعالیت ضد قارچی ایزوله ها با روش انتشار از چاهک انجام گردید. شناسایی ایزوله های مولد با استفاده از روشهای مورفولوژیک، بیوشیمیایی، فیزیولوژیک و ژنتیک صورت گرفت.

یافته­ها: در کل حدود 207 ایزوله اکتینوباکتری جداسازی گردید. نتایج بیانگر برتری محیط کشت عصاره خاک آگار با جداسازی 125 ایزوله اکتینوباکتری بود. نتایج تیمار فیزیکی برتری  تیمار حرارتی با جداسازی 85 ایزوله اکتینوباکتری را نشان داد. بدنبال آن تیمار خشک‌کردن و تیمار اشعه فرا بنفش با جداسازی به ترتیب 57 و 44 ایزوله قرار گرفتند. ارزیابی فعالیت ضد قارچی در مورد 100 ایزوله متمایز از لحاظ مورفولوژیک منجر به انتخاب 2 ایزوله فعال در مقابل قارچ‌های بیماریزای  Aspergillus nigerو Bipolaris sp.گردید. شناسایی ایزوله های مولد بر اساس ویژگی‌های مورفولوژیک، بیوشیمیایی و فیزیولوژیک تعلق ایزوله‌های مولد به جنس استرپتومایسس را نشان داد. نتایج حاصل از شناسایی ژنتیکی و تطابق توالی ژن 16s rRNA سویه‌های مولد و آنالیز فیلوژنتیک بیانگر ترادف %99 درصدی سویهStreptomyces sp. -11MG-با Streptomyces albus و ترادف %99 درصدی سویه 21- Streptomyces sp.MGبا griseus  Streptomycesداشت.                                                                                                               

نتیجه­گیری: بر اساس نتایج این پژوهش دو سویه‌ 11- Streptomyces sp. MG و 21- Streptomyces sp. MG به‌عنوان کاندیداهای مناسب به منظور مطالعات کنترل زیستی بیماری‌های قارچی در مزارع گندم پیشنهاد می گردند.

 

واژه های کلیدی: کنترل زیستی، آفت انباری گندم،پوسیدگی ریشه و طوقه گندم، اکتینوباکتری ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                                                        

 

 

 

 

J.Env. Sci. Tech., Vol 20, No.3, Autmn, 2018

 

 

 

 


                                                                                                                                                                                     

Isolation, identification and evaluation of the Actinobacteria derived from wheat farms to perform biological control of fungal diseases

 

Majid Gozari[5]

Maria Mohammadizadeh[6]

Mohsen Gozari[7] *

M_gozari@yahoo.com

Maryam Rafati [8]

 

Date Received: October 9, 2015

Admission Date:January 16, 2016

 

Abstract

Background and Objective: Nowadays pesticides are extensively used to protect food security worldwide. Due to their undesirable effects, they are considered as important environmental pollutants. Methods for pest biological control are enumerated as an alternative for chemical pesticide. This study was performed to isolate and identify the antifungal-compound-producing Actinobacteria againstAspergillus nigerfungi (stored product pest)and Bipolaris sp.(responsible for root and crown rot disease) from wheat farms of Hajiabad region, Hormozgan province.

Methods: Three farming sites were sampled in this study. Actinobacteria were isolated by soil extract agar and starch casein agar media. Antifungal activities were evaluated by well diffusion agar method. Potent isolates were identified through morphological, physiological, biochemical, and genetic analysis.

Findings: Approximately a total number of 207 Actinobacteria isolates were isolated. From two isolation media, the soil extract agar yielded 125 isolates and exhibited more efficacy. Results of physical treatments showed that heat treatment could isolate 85 colonies and followed by desiccation and UV treatments by 57 and 46 colonies respectively. Evaluation of the antifungal activities of 100 morphologically distinct isolates revealed that only two isolates exhibited antifungal activity against Aspergillus niger and Bipolaris sp. Identification of potent isolates according to morphological, biochemical and physiological properties showed that these isolates belong to Streptomyces genus. Genetically, identification and phylogenetic analysis based on16srRNA gene revealed a high similarity between Streptomyces sp.MG-11and Streptomyces albus (similarity: 99%) and between Streptomyces sp.MG-21 and Streptomyces griseus (similarity: 99%).

Discussion and Conclusions: Results of this study suggest that Streptomyces sp. MG-11 and Streptomyces sp.MG-21can be considered as appropriate candidates for biological control studies against the selected fungal diseases in wheat farms.

 

Keywords: Biological Control, Stored Product Pests, Root and Crown Rot of Wheat, Actinobacteria

 

مقدمه


علیرغم کاربرد گسترده روش‌های کنترل شیمیایی برای مقابله با بیماری‌های قارچی در کشاورزی، اثرات نامطلوب آن‌ها مانند بروز مقاومت به قارچ‌کش‌های شیمیایی و آلودگی محیط‌زیست توجه روزافزونی را به استفاده از راهکار مبارزه بیولوژیک معطوف نموده است(1). اﺳﺘﻔﺎده بی‌رویه از آفت‌کش‌ها درﻛﺸﺎورزی ﺑﺪون ﺗﻮﺟﻪ ﺑﻪ مخاطرات زیست‌محیطی سبب آﻟﻮدﮔﻲ محیط‌زیست به ‌ویژه ﻣﻨﺎﺑﻊآﺑﻲمی‌گردد. پساب‌هایﻛﺸﺎورزی ازﻣﻀﺮﺗﺮﻳﻦ ﻣﻨﺎﺑﻊآلاینده محیط‌زیست می‌باشند(2) اثرات مخرب و شدید آفت‌کش‌های شیمیایی‌برمحیط‌زیست از قبیل کاهش تنوع زیستی اکوسیستم‌ها،درخطر قرار دادن گونه‌های در معرض انقراض و اثرات کشنده بر حیات‌وحش و پرندگان،به کارگیری آن‌ها را مخاطره‌آمیزمی‌سازد(3). مطالعات اخیر بیانگر قرارگیری 62 گونه پرنده درخطر انقراض به دلیل استفاده از آفت‌کش‌ها در کشور کانادا و نیز کاهش 4 درصدی پرندگان زمین‌های کشاورزی در امریکا می‌باشد(4). فرآورده‌های کنترل زیستی عملکرد موفقیت‌آمیزی در راستای حفاظت از اکوسیستم‌های طبیعی و توسعه برنامه‌های بازسازی محیط‌زیست در سراسر جهان ایفا می‌کنند(5). از میان روش‌های کنترل زیستی آفات، عوامل کنترل میکروبی با کاربردی مشابه آفت‌کش‌های شیمیایی از بهترین جایگزین‌ها می‌باشند. کنترل میکروبی آفات در کشورهای در حال‌توسعه اهمیت روزافزونی یافته است(6). قارچ Aspergillus niger یکی ازآفات انباری گندم می‌باشد.این قارچ با رشد روی گندم سم اکراتوکسینA را تولید می‌نماید که به‌عنوان آلاینده دانه‌های حبوبات وغلات مانندگندم و جوشناخته‌شده و در مهره‌داران وگیاهان مسمومیت حاد ایجاد می‌نماید(7). قارچBipolaris sp.  عامل بیماری پوسیدگی ریشه و طوقه گندم می‌باشد. خسارت این بیماری درکشورهای مختلف متغیرگزارش‌شده است. در برزیل 9 تا 23 درصد(8) ،دراسترالیا 6 تا44 درصد (9) و درکانادا 30تا35 درصد(10)، خسارت ایجاد نموده است. درایران خسارت سالیانه بیماری پوسیدگی ریشه گندم3 تا 5/12 درصد گزارش‌شده است (11). اساس رسیدن به توسعه عوامل کنترل میکروبی آفات، جداسازی و شناسایی سویه‌های مؤثر و مناسب در مقابل آفات است (12). در این زمینه اکتینوباکتری ها به‌عنوان بخش مهمی از فلور میکروبی خاک و رسوبات دریایی در زمینه های مختلف مورد مطالعه قرارگرفته‌اند (14،13). این باکتری‌ها با مکانیسم های مختلف از قبیل تولید آنتی‌بیوتیک نقش مهمی را در میان­کنش‌های رقابتی و کنترل قارچ‌های بیماری­زای خاک زاد ایفا می‌ نمایند(15). در یک پژوهشWan و همکارانش در سال  2008 یک ترکیب ضد قارچی فرار را ازباکتریplatensis Streptomyces تولید نمودند(16). Coombsو همکارانش در سال 2004 بیان کردند که اکتینوباکتری­های اندوفیت دارای قابلیت کنترل زیستی بیماری‌های قارچی گندم می‌باشند (17).  Doohanوkhan  در سال 2009 موفق شدند با استفاده ازباکتری‌هایPseudomonas fluorescens  سویه‌های 249Mkb،  158  Mkbو frederiksbergensis  Pseudomonas سویه 202، شدت علایم بیماری فوزاریوم سنبله گندم که توسط قارچ Fusarium culmorum در گندم و جو ایجاد شده بود را کاهش دهند. این مطالعه با هدف جداسازی و شناسایی قابلیت کنترل زیستی اکتینوباکتری­های موجود در خاک‌های مزارع گندم منطقه حاجی‌آباد استان هرمزگان به ‌منظور مقابله با قارچ‌هایA. niger و Bipolaris sp. انجام گردید (18)

 

مواد و روش‌ها

1- میکروارگانیسم‌های مورداستفاده درتحقیق: در این پژوهش سویه‌های قارچی 5057 PTCC[9] :  A. nigerعامل بیماری آفت انباری گندم و 5225 PTCC   :  Bipolaris sp. مورداستفاده قرارگرفتند.

2- نمونه‌برداری

ازبین سایت‌های کشت گندم منطقه حاجی‌آباداستان هرمزگان سه سایت و درهرسایت 5 ایستگاه انتخاب شد ونمونه خاک با استفاده از مدل زیگزاگی و به‌صورت تصادفی جمع‌آوری گردید( 19). نمونه‌های خاک از بخش‌های مختلف خاک شامل ریزوسفر و عمق0 تا 30 سانتی‌متری از سطح خاک جمع‌آوری ‌و پس از انتقال به ظروف شیشه‌ای استریل به ﺁزمایشگاه منتقل شدند.

3- جداسازی و خالص‌سازی اکتینوباکتری­ها

برای افزایش جداسازی اکتینوباکتری­ها پیش تیمارهای فیزیکی مختلف شامل تیمارهای حرارتی، خشک‌کردن در هواو تیمار پرتو فرابنفش بر روی نمونه‌ها انجام شد.نمونه‌های تیمار شده با استفاده از روش رقت متوالی تا رقت 001/0رقیق‌سازی و با روش پخش کردن در سطح محیط‌های کشت نشاسته کازیین آگار وعصاره خاک آگار به میزانμl200 کشت داده شدند. محیط‌های کشت تلقیح شده به مدت 4 هفته در دمای C°28  درجه سانتی‌گراد گرماگذاری گردیدند(20).

4-  بررسیفعالیتضدقارچیجدایههایاکتینوباکتری

فعالیت جدایه های خالص‌شده اکتینوباکتری­ها علیه قارچ‌هایA. niger و Bipolaris sp. با استفاده از روش انتشار از چاهک مورد بررسی قرار گرفت. از محیط کشت‌های )HTB[10] بر اساس فرمول  (DSMZ[11] و[12] ISPII (تهیه شده از شرکت Hi media) برای ارزیابی تولید ترکیب ضدمیکروبی توسط ایزوله‌های اکتینوباکتری استفاده شد. به هرکدام از محیط‌های کشت سوسپانسیون اسپوری با رقت 107 بر میلی‌لیتر به میزان 5 درصد حجم محیط کشت تلقیح گردید. سپس محیط‌های تلقیح شده در انکوباتور شیکردار در دمای C°28 به مدت 5 روز با دور220 دور بر دقیقه گرماگذاری گردیدند. پس از اتمام دوره گرماگذاری، نمونه‌گیری از محیط‌های کشت حاوی باکتری انجام شد. نمونه‌ها به درون میکروتیوب ریخته شدند و پس از سانتریفیوژ با دورg 4000 به مدت20دقیقه مایع رویی برداشته شد. 100 میکرولیتر از مایع رویی هر یک از ایزوله‌ها به درون چاهک‌های تعبیه‌شده (به قطر mm4) در محیط سیب زمینی دکستروز آگار تلقیح شده با قارچ بیماری­زای موردنظر با حجم 25 میلی‌لیتر اضافه گردید و قطر هاله ممانعت از رشد ایجادشده پس از 4 روز مورد بررسی قرار گرفت(21).

5- شناسایی سویه‌های مولدترکیبات ضد قارچی

خصوصیات مورفولوژیک سویه‌ها با استفاده از تصاویر میکروسکوپی بررسی گردید(22). خصوصیات بیوشیمیایی ایزوله‌های مولد منتخب با استفاده از محیط‌های کشت های ISP از نظر مصرف منابع مختلف کربن و نیتروژن و نیز خصوصیات فیزیولوژیک از قبیل تولید آنزیم های مختلف مورد بررسی قرار گرفتند(23). به‌منظور شناسایی ژنتیکی سویه‌ها با DNA آن‌ها با استفاده از روش CTAB استخراج گردید. به دنبال آن ژن 16srRNAسویه‌ها با استفاده ازپرایمر هایf9و R 1541تکثیرشده و بعد از خالص‌سازی به ‌منظور تعیین توالی به همراه 5 µl پرایمر (برای هر نمونه)، به شرکت Promega ارسال شد. پس از تعیین توالی نوکلئوتیدی ژن16srRNA مربوط به ایزوله‌های موردنظر، توالی‌های به‌دست‌آمده با توالی‌های موجود در بانک ژن مورد آنالیز قرار گرفت (24).

6- آنالیز فیلوژنتیک و ثبت ژن

به منظور اطمینان از صحت تعیین توالی ژن16s rRNA سویه‌های منتخب از  نرم افزار DNA base 4.10  استفاده شد. به دنبال آن توالی های آنالیز شده در مقابل توالی‌های ژن16s rRNA  سایر گونه‌های موجود در بانک ژن NCBI بوسیله  نرم افزار  Megablast مورد مطابقت قرار گرفت. ثبت ژن توالی های بدست آمده بوسیله نرم‌افزار Banklt در بانک ژنNCBI انجام شد و پس از اعتبار سنجی از سوی NCBI  توالی های مورد نظر با شماره‌های دستیابی KJ028023 و  KJ028024ثبت گردید. آنالیز فیلوژنتیک سویه های منتخب با استفاده از نرم افزار MEGA6 انجام شد.

نتایج

1- جداسازی اکتینوباکتری­ها از نمونه‌های جمع‌آوری‌شده

به دنبال مرحله جداسازی با استفاده از 2 محیط کشت جداسازی مختلف حدود 207 جدایه اکتینوباکتری بدست آمد. محیط کشت عصاره خاک آگار با جداسازی 125 کلونی اکتینوباکتری بیشترین تعداد کلونی جداشده را به خود اختصاص داد و به دنبال آن محیط کشت نشاسته کازیین آگار 82 جدایه اکتینوباکتری را جدا نمود(شکل 1).

 

 

شکل1- جداسازی اکتینوباکتریها در دو محیط کشت مختلف

Figure1. Isolation of actinobacteria in two different culture media

 

 


 

 

2- بررسی اثر تیمارهای انجام‌شده بر جداسازی اکتینوباکتری­ها

تیمار حرارتی با جداسازی 85 جدایه اکتینوباکتری به‌عنوان بهترین تیمار ارزیابی شد و پس‌ازآن به ترتیب تیمار خشک‌کردن با جداسازی 57 جدایه و تیمار پرتوفرابنفش با جداسازی 44 جدایه قرار گرفتند. هم چنین از نمونه بدون تیمار نیز کشت شد که درمجموع 21 کلونی جداسازی گردید(شکل ۲).

 

 

شکل2-تأثیر تیمارهای فیزیکی بر جداسازی اکتینوباکتری­ها در محیط‌های کشت مختلف

Figure 2. Effect of physical treatment on isolation of actinobacteria in different culture media

 

 

3- ارزیابی فعالیت ضد قارچی اکتینوباکتری های جداشده در مقابلA. nigerوBipolaris sp.

مقایسه تولید ترکیبات ضدقارچی در 2 محیط کشت مایع HTBوISP II broth  پس از مدت 5 روز از کشت باکتری بیانگر تولید میزان بیشتر ترکیبات ضد قارچی در محیط HTB بود. (جدول ۱، شکل 3).

 

 

جدول1- ارزیابی فعالیت ضد قارچی اکتینوباکتری­های جداشده

Table 1. Evaluation of antifungal activity of isolated actinobacteria

شماره ایزوله

محیط کشت

قطر هاله ممانعت از رشد(mm)

A. niger

Bipolaris sp.

MG-11

HTB

12

15

ISP II

-

10

MG-21

HTB

 

ISP II

12

 

-

14

 

-

    

 

 

 

 

 

 

 الف A

 ب

شکل 3- ارزیابی فعالیت ضد قارچی سویه های مولد پس از 4 روز از کشت قارچ  الف.   MG- 11 ب.MG- 21

Figure 3. Evaluation of antifungal activity of putative strains after 4 days.  A. MG-11 B. MG-21

 

 

4- شناسایی اکتینوباکتری­های مولد ترکیب ضد قارچی

 

شناسایی مورفولوژیک اکتینوباکتری­های مولد جداشده شامل شکل ماکروسکوپی و میکروسکوپی، رنگ مسیلیوم های رویشی و هوایی و خصوصیات رشدی شامل میزان رشد و تولید اسپور در محیط‌های مختلف ویژگی‌های مورفولوژیک و جدایه های مولد MG-11وMG-21 به ترتیب درشکل(2)، جدول(2و 3) نشان داده شد. خصوصیات بیوشیمیایی و فیزیولوژیک جدایه های مولد از قبیل مصرف منابع کربن و نیتروژن و تولید آنزیم‌های مختلف مورد بررسی قرار گرفت(جدول 4). این نتایج تعلق سویه‌های مولد به جنس Streptomyces را نشان داد.
شناسایی ژنتیکی سویه‌های مولد پس از استخراج DNA ژنومی وتکثیر ژن16s rRNA سویه‌های مولدمنجر به تولید محصولی با وزنbp1500 گردید (شکل 5). نتایج حاصل ازتطابق توالی بدست آمده از سویه‌های مولد با سویه‌های موجود در بانک اطلاعاتی نوکلئوتیدها درNCBI[13] بیانگر همولوژی 99 درصدی سویه‌هایMG-11 باStreptomyces albus  و MG-21 با  Streptomyces griseus بود.

 


    

الف

 

ب

 

  

شکل 4- ویژگی­های ماکروسکوپی و میکروسکوپی سویه های مولد الف. MG- 11  ب. MG- 21

Figure 4. Macroscopic and Microscopic features of putative strains A. MG-11  B. MG-21

 

جدول2- شناسایی بیوشیمیایی و فیزیولوژیک سویه های مولد

Table 2. Biochemical and physiological identification of potent strains

Utilization of

MG-11

MG-21

Enzyme

MG-11

MG-21

glucose

+

+

Gelatin

+

+

Fructose

-

+

Citrate

+

-

Xylose

-

+

Urease

+

-

Arabinose

-

+

Arginine

+

+

Rhamnose

-

-

VP

+

+

Sucrose

+

-

Indol

-

-

Raffinose

-

-

H2S

-

-

Mannose

-

-

Hemolysis

-

-

Maltose

+

+

 

 

 

 

 

 

جدول 3- رنگ میسلیوم های هوایی و رویشی سویه های  مولددر محیط‌های مختلف

Table 3. color of aerial and vegetative mycelium of putative strains in different culture media

محیط کشت

رنگ میسلیوم

ISP II

ISP III

ISP IV

ISP V

MG-11

رویشی

زرد

زرد

کرم

کرم

هوایی

خاکستری

زرد

کرم

زرد

MG-21

رویشی

زرد

زرد

زرد

زرد

هوایی

سفید

سفید

سفید

سفید

جدول 4- ویژگی‌های رشدی سویه های  مولد در محیط‌های مختلف

Table 4. Growth features of putative strains in different culture media

MG-21

MG-11

مشخصه

 

G

G

رشد

ISP II

G

G

تولید اسپور

I

I

رشد

ISP III

I

I

تولید اسپور

I

G

رشد

ISP IV

I

I

تولید اسپور

I

I

رشد

ISP V

I

I

تولید اسپور

I

I

رشد

ISP VI

N

N

تولید اسپور

I

I

رشد

ISP VII

N

I

تولید اسپور

I

I

رشد

CDA

I

G

تولید اسپور

G

G

رشد

BA

G

G

تولید اسپور

I

G

رشد

NA

N

N

تولید اسپور

G: رشد یا تولید اسپور خوب    I: رشد یا تولید اسپورمتوسط    N: بدون رشد یا تولید اسپور

 

 

شکل 5- الکترفورز ژن16s rRNAتکثیرشده در واکنش PCR برای سویه‌های مولد ترکیب ضد قارچی. درچاهک اول(سمت چپ ژل)نشان گر وزنی100bpDNA Ladderبارگذاری شده است.

Figure 5. 16s rRNA gene electrophoresis amplified in PCR reaction from antifungal producing strains. First well was loaded by 100bpDNA Ladder

           


5- آنالیز فیلوژنتیک سویه‌های مولد ترکیب ضد قارچی

آنالیز فیلوژنتیک توالی ژن 16s rRNAسویه‌های مولد جداشده با نزدیک‌ترین سویه‌ها شناسایی‌شده با استفاده از نرم‌افزار MEGA 6 بیانگر قرارگیری سویه‌هایMG-11 با Streptomyces albus و -21 MG با Streptomyces griseus در دو خوشه جداگانه بود(شکل 6).


 

 

شکل 6. آنالیز فیلوژنتیک سویه‌های مولد ترکیب ضد قارچی

Figure 6. Phylogenetic analysis of antifungal producing strains

 

 

 

 

 

بحث و نتیجه‌گیری


امروزه یافتن سویه‌های بومی مولد ترکیبات ضد میکروبی به منظور کنترل زیستی آفات کشاورزی مورد توجه قرارگرفته و نمونه‌های تجاری‌سازی شده آن­ها به ‌عنوان ابزاری جدید در خدمت مدیریت محیط زیستی آفات در بازار موجود می‌باشد (25). در این مطالعه به منظور دستیابی به سویه های بومی کنترل کننده آفات قارچی مورد نظر نمونه برداری از خاک مزارع گندم انجام شد. استفاده از سویه های بومی کارایی میدانی فرآیند کنترل زیستی را ارتقا بخشیده و شانس یافتن گزینه های موفق را افزایش می­دهد. براساس نتایج ارایه ‌شده بیشترین کلونی اکتینوباکتری با استفاده از محیط کشت عصاره خاک آگار بدست آمد. پس ‌از آن محیط کشت نشاسته کازیین آگار تعداد 85 جدایه را جداسازی نمود. این تفاوت در میزان جداسازی اکتینوباکتری­ها به دلیل فرمولاسیون محیط کشت عصاره خاک آگار است که دارای ترکیبات مشابه خاک می‌باشد. درحالی‌که محیط کشت نشاسته کازیین آگار دارای منبع کربن نشاسته بوده که یک هیدروکربن به نسبت پیچیده است و میکروارگانیسم‌های دارای آنزیم آمیلاز می‌توانند آن را مصرف کنند. منبع نیتروژن این محیط کشت نیترات پتاسیم و کازئین است که نیازهای یک میکروارگانیسم را برطرف می‌کنند(26). در همین راستا  Hamakiو همکاران در سال 2005 گزارش نمودند که محیط کشت عصاره خاک آگار به‌عنوان محیط مناسبی برای جداسازی اکتینوباکتری­های جدید می‌باشد. آن‌ها موفق به جداسازی گونه‌های جدید اکتینوباکتری­های Bradyrhizobium گردیدند(27). در زمینه استفاده از تیمارهای حرارتی و نقش آنها در افزایش کارایی جداسازی گونه های اکتینوباکتری­ها مطالعات متعددی انجام شده است(28). در مطالعه حاضر تیمار حرارتی با جداسازی 85 جدایه اکتینوباکتری بهترین نتیجه را ارایه نمود و سپس تیمار خشک‌کردن با 57 جدایه و تیمار پرتو فرابنفش با جداسازی 44 جدایه در رده‌های بعدی قرار گرفتند. کارایی جداسازی تیمار حرارتی احتمالاً به دلیل حذف قارچ‌های مزوفیل افزایش یافت. رشد نسبتا سریع­تر قارچ های مزوفیل در محیط کشت جداسازی باعث آلودگی و نیز کمبود مواد مغذی مورد نیاز برای رشد اکتینوباکتری­ها شد. تیمار خشک‌کردن عموماً باکتری‌های گرم منفی را از بین برد و پرتو فرابنفش باکتری‌های حساس به UV را حذف نمود(29). در کل حدود 207 جدایه بدست آمد که با توجه به مطالعات مرفولوژیک تعداد 100 جدایه متمایز برای ارزیابی فعالیت ضد قارچی انتخاب گردید. مقایسه تولید ترکیبات ضد قارچی در 2 محیط کشت مایع HTBو ISP II broth  بیانگر میزان تولید بیشتر جدایه های مولد در محیط HTB داشت. این نتیجه می‌تواند به دلیل استفاده از عناصر کمیاب مانند کلرید کبالت و محتوای پروتئین بالاتر محیط HTB نسبت بهISPII باشد زیرا کبالت بخشی از ساختار ویتامین B12 است که به‌عنوان یک کوآنزیم نقش مهمی در فرایندهای متیلاسیون و واکنش‌های بازآرایی اسکلت کربن آنتی‌بیوتیک‌ها دارد(30). با توجه به نتایج، آنتی‌بیوتیک تولیدشده توسط سویه‌هایStreptomyces sp. MG-11 و MG-21 Streptomyces sp. تأثیر بیشتری بر قارچ Bipolaris sp. نسبت بهA. niger  داشت. این اثر می‌تواند به علت تفاوت الگوی حساسیت به آنتی‌بیوتیک به دلیل تفاوت های ساختاری و فیزیولوژیک قارچ‌های مورد بررسی ‌باشد. در همین زمینه Compant و همکاران نشان دادند سویه‌هایStreptomyces با تولید آنزیم β-1 و 3-گلوکاناز دیواره سلولی قارچ پاتوژنF. oxysporum را تجزیه می‌نماید و اثر کنترلی خود را ایفا می‌کند(31).در مطالعه دیگری Shimizuو همکارانش گزارش دادند از میان 178 ایزوله اکتینوباکتری 11 سویه قادر به تولید ترکیبات ضد قارچی در مقابل قارچ  Colletotrichumعامل آنتراکنوز خیار بودند (32).  شناسایی جدایه های مولد در مطالعه حاضر با استفاده از روش‌های چند مرحله‌ای شامل مطالعات میکروسکوپی و ماکروسکوپی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیک بیانگر تعلق باکتری‌های جداشده به جنس  Streptomycesبود. شناسایی ژنتیکی سویه‌های جداشده با روش تکثیر ژن 16s rRNA نشان دهنده ترادف 99 درصد سویه  Streptomyces sp.MG-11با باکتری S. album و ترادف 99 درصدی سویه-21 Streptomyces sp.MG با باکتری S. griseus بود. در این زمینه Someya و همکاران در مطالعه ای فعالیت ضد قارچی یک سویه کاندیدای کنترل زیستی را در مقابل قارچ های بیماریزای  R. solani و  F. oxysporum نشان دادند. نتایج آزمون های شناسایی نشان داد این سویه به گونه Serratia marcescens تعلق داشت(33). در مطالعه دیگری Amein  و همکارانش در سال 2008 یک سویهباکتری بومی Pseudomonas fluorescens را شناسایی نمودند که در شرایط میدانی به طور قابل ملاحظه ای موجب رشد و افزایش محصول گندم گردید. (34). آنالیز فیلوژنتیک سویه‌های مولد ترکیب ضد قارچی و مقایسه آن‌ها با سایر سویه‌های مطالعه شده نشان داد که سویهStreptomyces sp.MG-11 با سویه Streptomyces spectabilis CMU-PA101کهاز گونهپاندانوس از تایلند جداشده بود در یک خوشه قرار می‌گیرد (35). سویهStreptomyces sp.MG-21 ازلحاظ تکاملی زودتر از سایر گونه‌های مورد بررسی انشقاق یافته است. در این پژوهش قابلیت کنترل زیستی دو سویه Streptomyces‌ جداشده از مزارع گندم استان هرمزگان در فاز آزمایشگاهی تأیید گردیدکه می‌تواند گامی مؤثر در جهت دستیابی به سویه‌های کنترل‌کننده بیماری‌های قارچی با قابلیت تجاری‌سازی باشد. با توجه به بومی بودن سویه‌های Streptomyces sp.MG-11 و-21Streptomyces sp.MG سازش‌های اکولوژیک را با محیط خود یافته‌اند و بهترین گزینه برای مدیریت محیط زیستی بیماری‌های قارچی گندم در منطقه می‌باشند. به‌کارگیری نتایج حاصل از این تحقیق می‌تواند استراتژی جدیدی برای کاهش مصرف سموم و آلاینده‌های شیمیایی در مزارع گندم و درنتیجه کاهش آلودگی‌های محیط‌زیست را مطرح نماید و ابزاری جدید در جهت کنترل زیستی در اختیار برنامه‌های مدیریت تلفیقی آفات به‌عنوان بخشی از مدیریت محیط‌زیست قرار دهد.

 

 

 

Reference

  1. Council, E.S.R., 2008. Biological Alternatives to Chemical Pesticides. Science Daily. In http://www.sciencedaily.com/releases/2008/10/081008065841.htm.
  2. Braden, J.B. and J.S. Shortle, 2013. “Agricultural Sources of Water Pollution,” In Encyclopedia of Energy, Natural Resource and Environmental Economics, Ed. J. Shogren, Chap. 111. Elsevier, Amsterdam. pp.81-85.
  3. Wasim Aktar, Md., Sengupta, Dwaipayan., Chowdhury Ashim., 2009. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards.  Interdisciplinary Toxicology.2 (1): 1–12.
  4. Weber, C., 2008.For the Consideration of Biodiversity in Plant Protection Legislation. pp. 15.
  5. Van Driesche, R.G, Carruthers, R.I, Center, T., Hoddle, M.S., Hough-Goldstein, J,. Morin, L. Smith, L,. Wagner, D.L., Blossey, B., et al.2010. Classical biological control for the protection of natural ecosystems. PSIS/Entomology, University of Massachusetts, Fernald Hall, Amherst, MA 01003, USA. Biological Control54 .2010. S2–S33.
  6. El-Bendary, M.A., 2006. Bacillus thuringiensis and Bacillus sphaericus biopesticides production. Journal of Basic Microbiology. 46, 158–170.
  7. EPA, 1997. Aspergillus niger Final Assessment, Risk, see information in:http: www.epa.gov/biotech_rule/pubs/fra/fra006.htm.extension systems.39 5.
  8. Diehl Y.A., Tinline R.D., Kochhann R.A., Shipton P.Y., and Rovira A.D. 1982. The effect of fallow periodson common root rot of wheat in Rio Grande do sul, Brazil. Phytopathology. 72: 1279-1301.
  9. Piccinni G., Shriver J.M., and Rush C.M. 2001. Relationship among seed size, planting date, and common root rot in hard red winter wheat. Plant Dis. 85: 973-976.
  10. Ledingham. R. J, Atkinson. T.G.: Horricks. J.S.: Mills. J. T, Pienini. LJ and Tinline.R.D., 1973. Wheat losses due to common root rot in the Prairie provinces of Canada. 1 969-7 1. Can. Plant Dis. Surv. 53: 1 1 3-22.
  11. Mansouri, B. 2003, Damage due to Karnal bunt disease in wheat commercial
    varieties, 23rd Iranian Plant Protection Congress, Razi University, Kermanshah, Iran. (In Persian)
  12. Berdy, J .2005, Bioactive Microbial metabolite, Journal of Antibiotics,58:493-496.
  13. Gozari M, Mortazavi M, Bahador N, Tamadoni Jahromi S, Rabbaniha M. Isolation and screening of antibacterial and enzyme producing marine actinobacteria to approach probiotics against some pathogenic vibrios in shrimp Litopenaeus vannamei. IJFS. 2016; 15 (2):630-644.
  14. Gozari M, Mortazavi M, Karimzadeh R, Ebrahimi M, Dehghani R. Isolation, Identification and Evaluation of antimicrobial activity of Actinomycetes from marine sediments of Persian Gulf (Hormozgan Province). ISFJ. 2017; 25 (1):81-93.
  15. Iznaga, Y., Lemus, M., González, L., Garmendía, L., Nadal, L. and Vallín, C. 2004. Antifungal activity of actinomycetes from cuban soils. Phytotherapy Research., 18, 494-496.
  16. Wan, M.G., Li, G.Q., Zhang, J.B., Jiang, D.H., Huang, H.C., 2008. Effect of volatile substances of Streptomyces platensis F-1 on control of plant fungal diseases. Biological Control 46, 552–559.
  17. Coombs JT, Michelsen PP, Franco CMM, 2004. Evaluation of entophytic actinobacteria as antagonists of Gaeumannomyces graminis var. tritici in wheat. Biological control 29:359–366.
  18. Khan M. R,. Doohan. F. M. 2009. Bacterium-mediated control of Fusarium head blight disease ofwheat and barley and associated mycotoxin contamination of grain, University College Dublin, Belfield, Biological Control 48 .42–47.
  19. Carter M.R., Gregorich E.G,2008. Soil Sampling and Methods of Analysis. CRC Press Taylor & Francis Group.34p
  20. .Hayakawa M, Sadakata T†, Kajiura T, Nonomura H, 1991. New methods for the highly selective isolation of Micromonospora and Microbispora from soil, Journal of Fermentation and Bioengineering 72: 5, 320–326.
  21. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K.-H., Stackebrandt, E. (Eds.), 2006. The Prokaryotes, vol.3. Springer, New York, pp. 652–668.
  22. Shirling, E. B. & Gottlieb, D., 1966. Methods for characterization of Streptomyces species.
    International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology16, 313–340.
  23. Williams, S. T. Goodfellow, M. Alderson, G. Wellington, E. M. H. Sneath, P. H. A. and Sackin, M. J.,1983. Numerical classification of Streptomyces and related genera. Journal of general microbiology, 129, 1743–1813.
  24. Kieser, T, Bibb, M.J., Buttner, M.J., Chater, K.F., and Hopwood, D.A, 2000. Practical Streptomyces Genetics. Norwich: The John Innes Foundation.
  25.  Fravel, D.R., 2005. Commercialization and implementation of biocontrol. Annual. Rev. Phytopathology. 43, 337–359.
  26. Moat, Albert G., John W. Foster, and Michael P. 2003.Spector, eds. Microbial physiology. Wiley. Com.
  27. Hamaki, T.,Suzuki M, fudou R, jojima Y, kajiura T, tabuchi A, sen Kand shibai H, 2005. Isolation of novel bacteria and actinomycetes using Soil Axtract Agar medium, Journal of Bioscience and Bioengineering, 99, 5: 485-492.
  28. Goodfellow M2010. Selective Isolation of Actinobacteria, In Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, Third Edition. ASM Press, Washington, DC, p 13-27.
  29. Hayakawa M, Sadakata T†, Kajiura T, Nonomura H, 1991. New methods for the highly selective isolation of Micromonospora and Microbispora from soil, Journal of Fermentation and Bioengineering 72: 5, 320–326
  30. Tsueng G, Sing Lam K, 2009. Effect of cobalt and vitamin B12 on the production of salinosporamides by Salinispora tropica. The Journal of antibiotics, Tokyo. Apr;62(4):213-6.
  31. Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clément, C. and Ait Barka, E, 2005. Useof plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects. Applied and Environmental Microbiology. 71:4951–4959.
  32. Masafumi, Shimizu., Sachiko, Yazawa., Yusuke, Ushijima., 2009, A promising strain of endophytic Streptomyces sp. for biological control of cucumber anthracnose, The Phytopathological Society of Japan and Springer, J Gen Plant Pathol ,75:27–36.
  33.  Someya N, Kataoka N, Komagata T, Hirayae K, Hibi T, Akutsu K., 2000.Biological control of cyclamen soilborme disedses by Serratia marcescens strain B2. Plant Dis 84:334–340.
  34. Amein T, Omer Z, Welch C., 2008. Application and evaluation of Pseudomonas strains for biocontrol of wheat seedling blight. Crop Prot 27:532–536
  35. Khamna S, Yokaota A, Peberdy FJ, Aiumyong S., 2009. Antifungal activity of Streptomyces spp. isolated from rhizosphere of Thai medicinal plants. International Journal of Integrative Biology; 6:143-147

 

 



1- دانش آموخته کارشناسی ارشد مدیریت محیط زیست ، دانشکده مهندسی منابع طبیعی ،دانشگاه آزاد اسلامی، واحد بندرعباس، ایران

2- استادیار، گروه مدیریت محیط زیست ،دانشکده مهندسی منابع طبیعی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد بندرعباس، ایران

3- دکتری تخصصی میکروبیولوژی، بخش بیوتکنولوژی، پژوهشکده اکولوژی خلیج فارس و دریای عمان، موسسه تحقیقات علوم شیلاتی کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی ایران *(مسوول مکاتبات)

4- باشگاه پژوهشگران جوان و نخبگان، واحد تهران شمال ، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

1- M.Sc. in Environmental Management, Department of Environmental Management, Bandar Abbas Branch, Islamic Azad University, Bandar Abbas, Iran

2- Assistant Professor, Department of Environmental Management, Bandar Abbas Branch, Islamic Azad University, Bandar Abbas, Iran

3- Department Biotechnology, Persian Gulf and Oman Sea Ecological Research Institute, Iranian Fisheries Research Organization, Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO)-Bandar Abbas- Iran* (Corresponding Author)

4- Young Researchers and Elite Club, North Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

1. Persian Type Culture Collection

1- HickeyTresner broth

2- German Collection of Microorganisms and Cell Culture

3- International Streptomyces Project II

1- National Center for Biotechnology Information

Reference

  1. Council, E.S.R., 2008. Biological Alternatives to Chemical Pesticides. Science Daily. In http://www.sciencedaily.com/releases/2008/10/081008065841.htm.
  2. Braden, J.B. and J.S. Shortle, 2013. “Agricultural Sources of Water Pollution,” In Encyclopedia of Energy, Natural Resource and Environmental Economics, Ed. J. Shogren, Chap. 111. Elsevier, Amsterdam. pp.81-85.
  3. Wasim Aktar, Md., Sengupta, Dwaipayan., Chowdhury Ashim., 2009. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards.  Interdisciplinary Toxicology.2 (1): 1–12.
  4. Weber, C., 2008.For the Consideration of Biodiversity in Plant Protection Legislation. pp. 15.
  5. Van Driesche, R.G, Carruthers, R.I, Center, T., Hoddle, M.S., Hough-Goldstein, J,. Morin, L. Smith, L,. Wagner, D.L., Blossey, B., et al.2010. Classical biological control for the protection of natural ecosystems. PSIS/Entomology, University of Massachusetts, Fernald Hall, Amherst, MA 01003, USA. Biological Control54 .2010. S2–S33.
  6. El-Bendary, M.A., 2006. Bacillus thuringiensis and Bacillus sphaericus biopesticides production. Journal of Basic Microbiology. 46, 158–170.
  7. EPA, 1997. Aspergillus niger Final Assessment, Risk, see information in:http: www.epa.gov/biotech_rule/pubs/fra/fra006.htm.extension systems.39 5.
  8. Diehl Y.A., Tinline R.D., Kochhann R.A., Shipton P.Y., and Rovira A.D. 1982. The effect of fallow periodson common root rot of wheat in Rio Grande do sul, Brazil. Phytopathology. 72: 1279-1301.
  9. Piccinni G., Shriver J.M., and Rush C.M. 2001. Relationship among seed size, planting date, and common root rot in hard red winter wheat. Plant Dis. 85: 973-976.
  10. Ledingham. R. J, Atkinson. T.G.: Horricks. J.S.: Mills. J. T, Pienini. LJ and Tinline.R.D., 1973. Wheat losses due to common root rot in the Prairie provinces of Canada. 1 969-7 1. Can. Plant Dis. Surv. 53: 1 1 3-22.
  11. Mansouri, B. 2003, Damage due to Karnal bunt disease in wheat commercial
    varieties, 23rd Iranian Plant Protection Congress, Razi University, Kermanshah, Iran. (In Persian)
  12. Berdy, J .2005, Bioactive Microbial metabolite, Journal of Antibiotics,58:493-496.
  13. Gozari M, Mortazavi M, Bahador N, Tamadoni Jahromi S, Rabbaniha M. Isolation and screening of antibacterial and enzyme producing marine actinobacteria to approach probiotics against some pathogenic vibrios in shrimp Litopenaeus vannamei. IJFS. 2016; 15 (2):630-644.
  14. Gozari M, Mortazavi M, Karimzadeh R, Ebrahimi M, Dehghani R. Isolation, Identification and Evaluation of antimicrobial activity of Actinomycetes from marine sediments of Persian Gulf (Hormozgan Province). ISFJ. 2017; 25 (1):81-93.
  15. Iznaga, Y., Lemus, M., González, L., Garmendía, L., Nadal, L. and Vallín, C. 2004. Antifungal activity of actinomycetes from cuban soils. Phytotherapy Research., 18, 494-496.
  16. Wan, M.G., Li, G.Q., Zhang, J.B., Jiang, D.H., Huang, H.C., 2008. Effect of volatile substances of Streptomyces platensis F-1 on control of plant fungal diseases. Biological Control 46, 552–559.
  17. Coombs JT, Michelsen PP, Franco CMM, 2004. Evaluation of entophytic actinobacteria as antagonists of Gaeumannomyces graminis var. tritici in wheat. Biological control 29:359–366.
  18. Khan M. R,. Doohan. F. M. 2009. Bacterium-mediated control of Fusarium head blight disease ofwheat and barley and associated mycotoxin contamination of grain, University College Dublin, Belfield, Biological Control 48 .42–47.
  19. Carter M.R., Gregorich E.G,2008. Soil Sampling and Methods of Analysis. CRC Press Taylor & Francis Group.34p
  20. .Hayakawa M, Sadakata T†, Kajiura T, Nonomura H, 1991. New methods for the highly selective isolation of Micromonospora and Microbispora from soil, Journal of Fermentation and Bioengineering 72: 5, 320–326.
  21. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K.-H., Stackebrandt, E. (Eds.), 2006. The Prokaryotes, vol.3. Springer, New York, pp. 652–668.
  22. Shirling, E. B. & Gottlieb, D., 1966. Methods for characterization of Streptomyces species.
    International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology16, 313–340.
  23. Williams, S. T. Goodfellow, M. Alderson, G. Wellington, E. M. H. Sneath, P. H. A. and Sackin, M. J.,1983. Numerical classification of Streptomyces and related genera. Journal of general microbiology, 129, 1743–1813.
  24. Kieser, T, Bibb, M.J., Buttner, M.J., Chater, K.F., and Hopwood, D.A, 2000. Practical Streptomyces Genetics. Norwich: The John Innes Foundation.
  25.  Fravel, D.R., 2005. Commercialization and implementation of biocontrol. Annual. Rev. Phytopathology. 43, 337–359.
  26. Moat, Albert G., John W. Foster, and Michael P. 2003.Spector, eds. Microbial physiology. Wiley. Com.
  27. Hamaki, T.,Suzuki M, fudou R, jojima Y, kajiura T, tabuchi A, sen Kand shibai H, 2005. Isolation of novel bacteria and actinomycetes using Soil Axtract Agar medium, Journal of Bioscience and Bioengineering, 99, 5: 485-492.
  28. Goodfellow M2010. Selective Isolation of Actinobacteria, In Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, Third Edition. ASM Press, Washington, DC, p 13-27.
  29. Hayakawa M, Sadakata T†, Kajiura T, Nonomura H, 1991. New methods for the highly selective isolation of Micromonospora and Microbispora from soil, Journal of Fermentation and Bioengineering 72: 5, 320–326
  30. Tsueng G, Sing Lam K, 2009. Effect of cobalt and vitamin B12 on the production of salinosporamides by Salinispora tropica. The Journal of antibiotics, Tokyo. Apr;62(4):213-6.
  31. Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clément, C. and Ait Barka, E, 2005. Useof plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects. Applied and Environmental Microbiology. 71:4951–4959.
  32. Masafumi, Shimizu., Sachiko, Yazawa., Yusuke, Ushijima., 2009, A promising strain of endophytic Streptomyces sp. for biological control of cucumber anthracnose, The Phytopathological Society of Japan and Springer, J Gen Plant Pathol ,75:27–36.
  33.  Someya N, Kataoka N, Komagata T, Hirayae K, Hibi T, Akutsu K., 2000.Biological control of cyclamen soilborme disedses by Serratia marcescens strain B2. Plant Dis 84:334–340.
  34. Amein T, Omer Z, Welch C., 2008. Application and evaluation of Pseudomonas strains for biocontrol of wheat seedling blight. Crop Prot 27:532–536
  35. Khamna S, Yokaota A, Peberdy FJ, Aiumyong S., 2009. Antifungal activity of Streptomyces spp. isolated from rhizosphere of Thai medicinal plants. International Journal of Integrative Biology; 6:143-147