تلاشی در جهت ریزازدیادی گونه نمدار در شرایط درون شیشه‎ای

علوم و تکنولوژی محیط زیست، دورهنوزدهم، شماره یک، بهار 96

تلاشی در جهت ریزازدیادی گونه نمدار در شرایط درون شیشه‎ای

کمال قاسمی بزدی[1]^*

kamalghasemi@gmail.com

وحیده پیام نور[2]

مصطفی مهرداد[3]

اکرم احمدی[4]

چکیده

زمینه و هدف: نمدار از جمله گونه‎های مورد تهدید در شمال ایران است که درصد بسیار ناچیزی از جنگل‎های شمال کشور را تشکیل می‎دهد. از آن‎جایی‎که بذور نمدار در جوانه‎زنی با مشکلاتی هم‎چون خواب دوگانه فیزیولوژیکی (جنین) و مکانیکی (پوشش سخت پریکارپ) روبه‎رو هستند، استفاده از روش‎های کاربردی نظیر کشت بافت می‎تواند در کشت، بازسازی و حفاظت از ذخایر ژنتیکی موثر واقع شود.

روش بررسی: این پژوهش با هدف تعیین مناسب‎ترین ریزنمونه و بهترین ترکیب هورمونی محیط کشت به منظور بهینه‎سازی ریزازدیادی گونه نمدار در شرایط درون شیشه‎ای انجام گرفت. ریزنمونه‎ها به صورت تصادفی از بهترین پایه‎های نمدار در جنگل توسکاستان گرگان جمع‎آوری و کشت گردیدند.

یافته‎ها: داده‎های به ‎دست آمده با طرح کاملا تصادفی به وسیله نرم افزار MSTATC مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. با توجه به نتایج حاصل از این بررسی، از بین یازده ریزنمونه مورد آزمایش، ساقه حاوی جوانه انتهایی فلس‎دار به عنوان مناسب‎ترین ریزنمونه و IBA با غلظت 1/0 میلی‎گرم بر لیتر به عنوان مناسب‎ترین ترکیب هورمونی محیط کشت در ساقه‎زایی در نظر گرفته شد.

بحث و نتیجه‎گیری: امید می‎رود نتایج حاصله بتواند در تحقیقات کشت بافت و تکثیر و هم‎چنین در مطالعات پایه مولکولی در این گونه مفید واقع شود.

واژه‌های کلیدی: نمدار، محیط کشت، ریز نمونه، ساقه‎زایی، هورمون.

Attempt in order to Micropropagation of Linden In vitro

Kamal Ghasemi Bezdi^[5]*

kamalghasemi@gmail.com

Vahideh Payamnour[6]

Mostafa Mehrdad[7]

Akram Ahmadi[8]

Abstract

Background and: Linden is one of threatened species in north of Iran that form very small percentage of the northern forests. Since the linden seeds are facing with germination problems such as with dual physiological (the embryo) and mechanical (hard cover pericarp) dormancy that application such as tissue culture can be effective in planting, restoration and conservation of genetic resources.

Method: This study was carried out in order to determine the most suitable explants and the best hormone combination to optimize micropropagation of linden in vitro. Explants were collected and cultured randomly from the best individual of linden from Gorgan Touskaestan forest.

Findings: In light of results, from the eleven tested explants, stem containing terminal buds with scale were selected as the most suitable explants and IBA 0.1 mg/l was selected as the most appropriate medium hormonal combination in shoot regeneration.

Discussion and Conclusion: Obtained data were analyzed with a completely randomized design by MSTATC software. It is hoped that the achieved results can be reproduced and be helpful in tissue culture research and also the molecular basis studies.

Keywords: Linden, Medium, Explant, Shoot regeneration, Hormone

مقدمه

در سال‎های اخیر، علاقه به استفاده از روش‎های کشت در تکثیر انبوه و حفاظت از ژرم پلاسم گونه های گیاهی در حال تهدید افزایش یافته است. کاهش تنوع و کاشت به‎دلیل جنگل زدایی و افزایش تقاضا منجر به استفاده از روش‎های درون شیشه ای تکثیر به عنوان یک نیاز اقتصادی شده است (1). امروزه رشد سریع جمعیت، اهمیت به کارگیری علوم و فنون جدید را دو چندان کرده است. با علم به این موضوع که هر یک از سلول­های گیاهی تمایز نیافته توانایی تبدیل شدن به گیاه کامل را دارند، دریچه­ای تازه پیش روی دانشمندان و محققان علوم زیستی گشود و کشت درون شیشه‎ای نامیده شد. در مورد درختان جنگلی مشکلات خاص مربوط به نمونه‎برداری، خواب بذر، آلودگی‎های درون بذری و آفات و بیماری‎ها بر اهمیت موضوع افزوده است، به نحوی که در مقایسه با روش­های سنتی اصلاح گیاهان، تسریع قابل ملاحظه­ای در مدت اجرای برنامه­های اصلاحی به وجود آمد. امکان انجام تلاقی­های بین جنسی، نگه‎داری ذخایر توارثی، تولید گیاهان عاری از ویروس و تولید گیاهان هاپلویید که همه از کاربردهای مهم کشت بافت و سلول­ گیاهی می­باشند (2)، میسر شد.

   نمدار گیاهی از جنس Tilia، خانوادهTiliaceae، راسته  Malvalesو بومی نیم کره شمالی می‏باشد. تنها گونه آن در ایران، T. platyphyllos   با دو زیر گونه، در جنگل‏های نوار شمالی کشور شامل استان­های گیلان، مازندران و گلستان از ارسباران تا آستارا و مینودشت از جنگل‏های جلگه‏ای دریای خزر تا ارتفاعات پراکنده است و معمولا به صورت انفرادی در پناه درختان راش و بلوط زیست می‎کند (3). این گونه ﻋـــﻼﻭﻩ ﺑـــﺮ ﺍﺭﺯﺵ ﺍﻛﻮﻟﻮﮊﻳـــکی، ﺍﺯ ﺍﺭﺯﺵ ﺍﻗﺘﺼـــﺎﺩﻱ ﻧﻴـــﺰ ﺑﺮﺧﻮﺭﺩﺍﺭ می‎باشد به‎طوری که در اروپا و آمریکا برای ایجاد فضای سبز در پارک‎ها و حاشیه خیابان‎ها کاشته می‎شود، زیرا ضمن داشتن ظاهر زیبا، سریع رشد کرده و ارتفاع زیادی پیدا می­کند (4). عسل و چای حاصل ازآن در سطح جهان از اشتهار ویژه‎ای برخوردار است (5) و چوب آن بیشترین کارایی را در مجسمه‎سازی، قالب کلاه و کفش و کلیدهای پیانو دارد (4). این گونه را می­توان در زمره گیاهان دارویی نیز به حساب آورد. گل و برگ­های آن مصرف پزشکی دارد و دم‏کرده آن برای­ معالجات مختلف از قبیل سرماخوردگی بکار می­رود. در احیای جنگل‎های تخریب یافته و یا نیمه تخریب یافته میان‎بند تا بالابند جنگل‎های شمال می‎توان از کاشت آن به همراه گونه‎هایی نظیر راش و یا ممرز استفاده نمود (6) چنانکه در اروپای مرکزی به میزان زیاد در برنامه‎های احیاء و جنگل‎کاری مورد استفاده قرار گرفته است (7). نمدار درختی است رطوبت­پسند، طالب خاک‎های مرطوب و  نسبت به آب و مواد غذایی پر نیاز که اقلیم سرد یا معتدل را ترجیح می­دهد. دارای سرشت نوری سایه­پسند است و سیستم ریشه‎ای خود را به خوبی گسترش می‎دهد (5،8). تکثیر نمدار توسط بذر در جایی که خوب آبیاری شود عملی است ولی بذر‏های این گونه دارای خواب دوگانه مربوط به جنین (فیزیولو‍ژیکی) و پوشش بذر سخت و پریکارپ غیر قابل نفوذ (مکانیکی) می‏باشند. بنابراین جوانه­زنی به سختی در مدت زمان طولانی و با درصد کم قابل انجام است (9). مشکلات ناشی از قارچ‎های درون بذری نمدار در برخی رویش‎گاه‎ها شامل Fusariun sp، Alternaria sp و Penicillium sp بر مشکلات جوانه‎زنی این گونه افزوده است (10). استفاده از روش‎های نوینی مثل کشت بافت برای کشت، بازسازی و حفاظت از ذخایر ژنتیکی این گونه می‎تواند مفید باشد. 

   اولین گزارشات در زمینه کشت بافت گونه نمدار توسط Barker در سال 1969 ارایه شد (9). او از طریق کالوس‏زایی اقدام به کشت بافت T. americana نمود. از جمله کسانی که در کشت بافت نمدار فعال بوده و تحقیقات زیادی در این زمینه انجام داده است، Chalupaاستکهدرسال1984توانست از طریق جوانه‎های جانبی کشت درون شیشه‏ایT. cordataرا انجامدهد (11). وی در سال 1988 اعلام نمود کشت اندام‎های مختلف درT. cordataبا محیط کشت MS آن‎قدر موفقیت‎آمیز است که بعد از 5 سال برخی درختان به ارتفاع 3-4 متر رسیده‎اند (12). وی کشت همین گونه را با محیط کشت WPM  از طریق تکثیر ساقه گزارش نمود. همچنین تکثیر درون شیشه‎ای T. platyphyllos را در سال 2003 با استفاده از انواع اکسپلنت شامل تک گره‎های مختلف ساقه (ساقه‎های حاوی جوانه‎های مختلف) و نیز جوانه‎های سوماتیکی انجام و هر دو را موفقیت آمیز اعلام نمود (6). Yahyoglu و Ucler (1995) تاثیر دو محیط کشت MS و WPM  را از طریق کشت جنین بر روی T.rubra بررسی کردند، نتایج نشان داد دو محیط کشت تفاوت معناداری با یک‎دیگر در میزان باززایی نداشت (13). مناسب‎ترین غلظت ساکارز  gr/lit 30  برای هر دو محیط می‎باشد. Mala و همکاران (2001) میزان موفقیت تکثیر درون شیشه‎ای دو گونه نمدار  T. platyphyllosو  T. cordataرا با استفاده از جوانه‎های زمستانه و با غلظت‎های مختلف هورمونی مورد مقایسه قرار دادند، مشخص شد میزان ساقه‎زایی در T. cordataبیشتر از T. platyphyllos بوده و در عین حال ساقه‎زایی برای اکسپلنت‎های گرفته شده از قلمه‎ها عملکرد بهتری نسبت به اکسپلنت‎های گرفته شده از درختان مسن دارند (14).

   باززایی موفقیت‎آمیز از جوانه­های جانبی گونه  T. europea به عنوان اکسپلنت  (15) و گونه T. platyphyllos(16) از طریق تکثیر درون شیشه‎ای از دیگر گزارشات مربوطه است. در ایران، تنها یک تحقیق در مورد کشت بافت T. platyphillosتوسط شهرزاد (1376) صورت گرفته است و در قالب طرح تحقیقاتی گزارش شده است (17). مناسب­ترین جوانه­ها جهت کشت، جوانه­های انتهایی یا نزدیک انتهایی، بهترین محیط کشت WPM، هورمون‎های NAA و BA به ترتیب با غلظت‎های 01/0 و 5/0 میلی­گرم بر لیتر برای ساقه‎زایی و هورمون IBA به میزان 1/0 میلی­گرم بر لیتر برای ریشه­زایی معرفی شده است. در تحقیق دیگری که توسط میتسوکوری و همکاران (2009) بر روی گیاه Ponerorchis graminifolia Rchb.f انجام گرفت، محیط کشت MS به همراه هورمون‎های BA (44/4  μM) و NAA (μM 44/4) به عنوان محیط کشت بهینه در تکثیر این گونه معرفی گردید (18).

   جدا کردن بافت مناسب در زمان مناسب در کشت‎های درون شیشه‎ای, مساله بسیار مهمی است، چرا که مهم‎ترین جنبه ریزازدیادی درختان بالغ سر سخت، انتخاب ریز نمونه مناسب است. در بسیاری از موارد فقط تعداد اندکی از بافت‎ها واکنش مطلوب نشان می‎دهند. همین که نوع ریزنمونه با بالاترین قابلیت ریخت‎زایی شناسایی گردید، آزمایش‎های بعدی را می‎توان برای بهینه‎سازی عکس العمل آغاز کرد. ضرورت حضور یک تنظیم کننده رشد به خصوص در محیط غذایی و اثر آن بر رشد و سیر تکاملی قطعات مورد کشت، در درجه اول وابسته به نوع و گونه گیاهی بوده که نمونه مورد کشت از آن گرفته شده است.

   هدف از این پژوهش بررسی مناسب‎ترین ترکیب هورمونی محیط کشت برای تکثیر درون شیشه‎ای گونه نمدار و تعیین مناسب‎ترین ریزنمونه جهت ریزازدیادی نمدار است تا بتوان ریزازدیادی گونه نمدار را در شرایط درون شیشه‎ای بهینه‎سازی نمود.

مواد و روش‎ها

نمونه­برداری از جنگل توسکاستان گرگان در قطعه 4 سری 6 طرح گرمابدشت در ارتفاع حدود 650 متری از سطح دریا صورت گرفت. نمونه‎ها بلافاصله به آزمایشگاه منتقل و تمیز گردیدند. سپس با آب و مایع ظرفشویی شسته شدند تا کلیه آلودگی‏های سطحی حذف گردند. برای کاهش آلودگی­ ریزنمونه­ها عمل پیش‎سترون‎سازی نیز بر روی آن‎ها انجام شد، بدین طریق که از اسید اسکوربیک و محلول قارچ‎کش با هدف حذف مواد فنلی و آلودگی‎های قارچی استفاده گردید. برای این‎کار ریزنمونه‎ها به مدت 20 دقیقه در محلول حاوی600 میلی‎گرم بر لیتر اسیداسکوربیک، 4 گرم بر لیتر قارچ‌کش کاپتان و هیپوکلریت سدیم تجاری 5 درصد قرار داده شدند و بعد از آب‎کشی به مدت 3 دقیقه در زیر شیر آب مورد شستشو قرار گرفتند. به دلیل آلودگی‎های مکرر، تعداد زیادی از روش‎های سترون‎سازی تست و بهترین آن انتخاب و اعمال شد که شامل قرار دادن ریزنمونه‌ها به مدت 5 دقیقه در محلول سترون کننده حاوی 600 میلی‎گرم بر لیتر اسید اسکوربیک و هیپوکلریت سدیم تجاری10 درصد بود. با توجه به سر سخت بودن این گونه و تست‎های مکرر مربوط به جوانه‎ها و به منظور افزایش جوانه­زنی، سرشاخه‎ها قبل از شروع مراحل مربوط به کشت، در محلول­های محتوی آب مقطر و هورمون­های 2,4-D (در غلظت­های 1/0، 3/0، 5/0 و 1 میلی­گرم بر لیتر)، NAA (در غلظت­ 1 میلی­گرم در لیتر) و کنیتین 2 میلی­گرم بر لیتر به مدت 24 و 48 ساعت قرار داده شدند و اثرات آن‎ها بررسی گردید و مشخص شد قرار دادن سرشاخه‎ها در محلول محتوی آب مقطر و  NAA با غلظت 1 میلی گرم بر لیتر به مدت 24ساعت می‎تواند در نتایج تاثیرگذار و مفید واقع شود. سایر ترکیبات و غلظت‎های مورد بررسی در نتایج تاثیر زیادی نداشتند لذا سرشاخه ها به مدت 24 ساعت در محلول  NAA  با غلظت 1mlg^-1 قرار داده شدند.

   ریزنمونه‎های متفاوتی مورد آزمون قرار گرفت که شامل بذر کامل، بذر بدون پوسته، جنین، جوانه جانبی فلس‌دار، جوانه جانبی بدون فلس، جوانه انتهایی فلس‌دار،‌ جوانه انتهایی بدون فلس، ساقه حاوی جوانه جانبی فلس‌دار، ساقه حاوی جوانه جانبی بدون فلس، ساقه حاوی جوانه انتهایی بدون فلس و ساقه حاوی جوانه انتهایی فلس‌دار بودند.

   از محیط کشت  MSفاقد هورمون، حاوی g/lit 30 ساکارز و g/lit 7 آگار برای کشت اکسپلنت‎های مربوط به جنین و بذر و محیط کشت MS همراه با هورمون IBA به میزان 1/0 میلی‌گرم بر لیتر جهت کشت جوانه‎ها  استفاده شد. اسیدیته  برابر با 8/5 و دمای اتاقک رشد C° 25 ±2 تحت شرایط 16ساعت نور و 8 ساعت تاریکی در نظر گرفته شد. نوع و غلظت ترکیبات به‎کار رفته در محیط کشت‎های استفاده شده در تحقیق در جدول شماره (1) آمده است. داده‎های به‎دست آمده از تحقیق با استفاده از نرم‎افزار MSTATC مورد تجزیه و تحلیل‎ آماری قرار گرفت. جهت مقایسه میانگین‎ها از آزمون مقایسه میانگین چند دامنه‎ای دانکن استفاده گردید.

جدول 1- نوع و غلظت ترکیبات به کار رفته در محیط کشت‎های استفاده شده در تحقیق

Table 1-  type and concentration of the used compounds in the used culture media

نتایج

جهت تعیین مناسب‎ترین روش جهت استریل ریزنمونه‎ها، روش‎های مختلفی تست شد که عمدتا ناموفق یا بسیار کم بازده بودند. بهترین روش تعیین و در کشت ریزنمونه‎ها استفاده شد که شامل اعمال تیمار پیش سترون و استفاده از قارچ کش در آن و تیمار سترون شامل استفاده از اسید اسکوربیک و هیپوکلریت سدیم تجاری10 درصد بود. مناسب‎ترین نوع ریزنمونه جهت ریزازدیادی نمدار بر اساس درصد جوانه‎زنی در محیط کشت پایه MS تعیین گردید. ریزنمونه‎های مورد بررسی شامل بذر کامل، بذر بدون پوسته، جنین، ساقه حاوی جوانه جانبی بدون فلس، ساقه حاوی جوانه جانبی فلس‌دار، جوانه جانبی بدون فلس، جوانه جانبی فلس‌دار، ساقه حاوی جوانه انتهایی بدون فلس، جوانه انتهایی فلس‌دار، جوانه انتهایی بدون فلس و ساقه حاوی جوانه انتهایی فلس‌دار بودند. نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر نوع ریزنمونه بر میزان جوانه‎زنی ریزنمونه‎های گونه نمدار (جدول 2) معنی‎داری در سطح یک درصد را نشان می‎دهد.

جدول 2- نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر نوع ریزنمونه بر میزان جوانه‎زنی آن‎ها

در گونه نمدار در شرایط درون شیشه‎ای

Table 2- Variance analysis of explants type on germination in T. platyphyllos, in vitro

         ^{**: معنی دار در سطح یک درصد}

نتایج حاصل از مقایسه میانگین اثر نوع ریزنمونه بر میزان جوانه‎زنی آن‎ها در شرایط درون شیشه‎ای به روش آزمون چند دامنه‎ای دانکن در سطح پنج درصد (جدول 3) نشان داد که ریزنمونه‎ها در پنج کلاس مختلف قرار گرفتند. ریزنمونه ساقه حاوی جوانه انتهایی فلس‎دار با 25 درصد و جنین با 20 درصد جوانه‎زنی در گروه اول و ساقه حاوی جوانه انتهایی بدون فلس با 10 درصد و جوانه‌های جانبی و جوانه انتهایی بدون فلس با 33/8 درصد جوانه‎زنی در گروه بعدی قرار گرفتند. جوانه‌های جانبی و انتهایی فلس‎دار نیز درصد جوانه‎زنی بسیار پایینی را نشان دادند و بقیه ریز‌نمونه‌ها شامل بذر کامل، بذر بدون پوسته، ساقه‌های حاوی جوانه جانبی بدون فلس و فلس‌دار هیچ‌گونه جوانه‎زنی نداشتند.

جدول 3- نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثر ریزنمونه بر میزان جوانه‎زنی نمدار به روش آزمون چند دامنه‎ای دانکن

Table 3- Results of mean comparison of the effect of explants type on germination rate in T. platyphyllos by Duncan's multiple range tests

 میانگین‌هایی که دارای حروف مشترک می‌باشند از نظر آماری (در سطح 5 درصد) در یک گروه قرار دارند.

بر اساس مشاهدات و ثبت اطلاعات از جوانه‎زنی به وجود آمده از کشت‎های حاصل از ریزنمونه‎های مختلف، مشاهده شد که جوانه‎های حاصل از جنین‎ها در مدت زمان کمتری شروع به جوانه‎زنی نموده و کمترین سرعت جوانه‎زنی مربوط به زمانی بود که از ریزنمونه جوانه انتهایی یا جانبی بدون ساقه استفاده می‌شد و هم‎چنین حداکثر رشد مربوط به ساقه حاوی جوانه انتهایی فلس‎دار و بدون فلس بود، به این معنی که ریزنمونه‎های نام برده شده نسبت به جنین به زمان بیشتری برای شروع جوانه‎زنی نیاز داشتند ولی سرعت رشد بیشتری نسبت به جنین در مدت زمان مشابه پس از شروع جوانه‎زنی از خود نشان ‌دادند. در نهایت، ریزنمونه‎های ساقه حاوی جوانه انتهایی فلس‎دار و جنین به عنوان بهترین ریزنمونه انتخاب شدند (شکل1)

اثر هورمون‎های مختلف بر میزان درصد جوانه‎زنی در دو نوع ریزنمونه برتر بر روی محیط کشت MS جامد، با استفاده از طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار بررسی شد. نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی تاثیر نوع ریزنمونه و غلظت‎های مختلف هورمونی و اثر متقابل این عوامل بر میزان جوانه‎زنی ریزنمونه‎های نمدار در شرایط درون شیشه‎ای (جدول 4) نشان داد که نوع محیط کشت و اثر متقابل نوع محیط کشت و نوع ریزنمونه در شرایط درون شیشه‎ای در سطح یک درصد معنی‎دار بود، اما نوع ریزنمونه اثر معنی‎داری نشان نداد.

جدول 4-  نتایج تجزیه واریانس حاصل از بررسی نوع ریزنمونه و غلظت‎های مختلف هورمونی و اثر متقابل این دو عامل بر میزان جوانه‎زنی نمدار در شرایط درون شیشه‎ای

Table 4-Variance analysis of explants type and different hormonal concentration and interaction of these two factors on germination rate of T. platyphyllos in vitro

^**: معنی دار در سطح یک درصد           ^n.s. غیر معنی‎دار

نتایج حاصل از مقایسه میانگین اثر غلظت هورمون‎های محیط کشت بر میزان جوانه‎زنی و ساقه زایی نمدار به روش آزمون چند دامنه‎ای دانکن در سطح پنج درصد در جدول (5) آورده شده است. همان طوری که مشاهده می‎شود ترکیبات هورمونی مختلف محیط کشت در هشت گروه مجزا قرار گرفتند. محیط کشت با ترکیب هورمونی حاوی IBA به میزان 1/0 میلی‎گرم بر لیتر (کد 9) با 50/52 درصد جوانه‎زنی در جایگاه اول و محیط کشت حاوی کینتین به میزان 1 میلی‎گرم بر لیتر و IBA به میزان 1/0 میلی‎گرم بر لیتر (کد 3) با 17/39 درصد جوانه‎زنی در گروه دوم قرار گرفت. محیط کشت با کد 4 حاوی 2 میلی‎گرم بر لیتر کینتین به ‎همراه 1/0 میلی‎گرم بر لیتر IBA با 30 درصد جوانه‎زنی در جایگاه بعدی قرار گرفت. محیط کشت با کد 10 و با 67/11 درصد جوانه‎زنی و نهایتاً محیط کشت‎های با کد 7 که حاوی 2 میلی‎گرم بر لیتر BAP به همراه 1/0 میلی‎گرم بر لیتر 2,4-D بودند و محیط کشت حاوی NAA به میزان 5/0 میلی‎گرم بر لیتر (کد 11) به ترتیب با 17/10 و 33/8 درصد کمترین میزان زنده‎مانی ریزنمونه‎ها را به خود اختصاص دادند.

جدول 5- نتایج حاصل از مقایسه میانگین اثر غلظت هورمون‎های محیط کشت بر میزان جوانه‎زنی نمدار

Table 5- The results of the mean comparison of the effect of medium hormones on the germination of T. platyphyllos

میانگین‌هایی که دارای حروف مشترک می‌باشد از نظر آماری (در سطح 5 درصد) در یک گروه قرار دارند.

نتایج حاصل از مقایسه میانگین اثر متقابل نوع ریزنمونه × نوع محیط کشت در جدول (6) مشاهده شد که بر اساس آن‎ها داده‎های مربوط در 12 گروه مختلف قرار گرفتند. بیشترین میزان جوانه‎زنی  مربوط به  ساقه حاوی جوانه انتهایی فلس‎دار در محیط کشت حاوی 1/0 میلی‎گرم بر لیتر بود که به تنهایی در گروه اول قرار گرفت. ریزنمونه ساقه حاوی جوانه انتهایی فلس‎دار با محیط کشت حاوی یک میلی‎گرم بر لیتر کینتین به همراه 1/0 میلی‎گرم بر لیتر IBA و جنین با محیط کشت حاوی 1/0 میلی‎گرم بر لیتر IBA هر کدام با 40 درصد جوانه‎زنی در گروه دوم جای گرفتند، جنین با محیط کشت حاوی یک میلی‎گرم بر لیتر کینتین به همراه 1/0 میلی‎گرم بر لیتر IBA با 33/38 درصد جوانه‎زنی در گروه بعدی قرار گرفت که این بیان‎گر تاثیر غلظت پایین هورمون IBA و هورمون کینتین در ساقه‎زایی ریزنمونه‎های نمدار است. ساقه حاوی جوانه انتهایی فلس‎دار با محیط کشت‎های حاوی 2/0 و 5/0 میلی‎گرم بر لیتر NAA هر کدام به ترتیب با 66/1 و صفر درصد جوانه‎زنی کمترین میزان جوانه‎زنی را از خود نشان دادند. باززایی حاصل از ریزنمونه‎های متفاوت نمدار در شکل (2) آمده است.

جدول 6- نتایج حاصل از مقایسه میانگین حاصل از بررسی اثر متقابل نوع ریزنمونه × نوع محیط کشت بر میزان جوانه‎زنی نمدار در شرایط درون شیشه‎ای

Table 6- The results of mean comparison of interaction effects of explants × type of medium on germination rate of T. platyphyllos in vitro

- میانگین‌هایی که دارای حروف مشترک می‌باشد از نظر آماری (در سطح 5 درصد) در یک گروه قرار دارند

شکل 2-  باز‎زایی حاصل از ریزنمونه‎های نمدار: 1) گیاه‎چه حاصل از جنین، 2) کالوس حاصل از جنین، 3) ساقه‎زایی حاصل از  ساقه حاوی جوانه انتهایی فلس‎دار، 4) ساقه‎زایی حاصل از ساقه حاوی جوانه انتهایی بدون فلس

Figure 2- Regeneration of T. platyphyllos explants: 1) plantlet derived from embryos, 2) shoot regeneration from the embryos, 3) shoot regeneration from stem containing the terminal bud with scale, 4) Shoot regeneration of stem containing terminal bud without scales

پس از به‎دست آوردن بهترین تیمار برای شاخه‎زایی، شاخه‎های نمدار به میزان مناسب تکثیر و هنگامی که طول هر شاخه به حد مناسبی رسید (حدود 2 تا 3 سانتی‎متر) وارد مرحله ریشه‎زایی گردیدند. بدین منظور از 2 روش استفاده شد، در روش اول، ساقه‎های ایجاد شده، در محیط کشت پایه فاقد هورمون حدود 15 تا 20 روز، مستقر و سپس به محیط ریشه‎زایی منتقل شدند. در روش دوم، ساقه‎های تشکیل شده مستقیماً و بلافاصله در محیط کشت‎های مناسب ریشه‎زایی قرار داده شدند. محیط کشت‎های مورد استفاده مخصوص ریشه‎زایی، شامل محیط کشت MS حاوی اکسین‎های NAA با غلظت‎های 2/0 و 5/0 میلی‎گرم بر لیتر و IBA با غلظت های 1/0، 2/0، 5/0 و 1 میلی‎گرم بر لیتر و هورمون D،4-2 بوده است. براساس آزمایشات انجام شده، هیچ کدام از تیمارهای انجام شده در مرحله اخیر ریشه‎زایی، موفق به ریشه‎دار نمودن ساقه‎های ایجاد شده نگردید و این مرحله احتیاج به تحقیق بیشتر و تیمارهای ریشه‎زایی بیشتری خواهد داشت.

بحث و نتیجه گیری

ابزارهای بیوتکنولوژی نظیر کشت بافت می‎تواند یکی از راه‎های غلبه بر مشکلات جوانه زنی گونه‎های مختلف گیاهی از جمله درختان جنگلی باشد. نمدار، ﺍﺯ ﮔﻮﻧﻪ‎ﻫﺎﻱ گیاهی ﺑﺎ ﺍﺭﺯﺵ و با دیر زیستی طولانی (ﮔﺎﻫﻲ ﺗﺎ هزار ﺳﺎﻝ) با دامنه وسیع پراکنش ارتفاعی می‎باشد. بر اساس اطلاعات جمع‎آوری شده از نهالستان­های شمال کشور، تولید نهال نمدار تاکنون با مشکلات جدی مواجه بوده است (19). روش‎های کشت بافت ممکن است بتوانند راه حل مناسبی برای حل مشکل فوق باشند. موضوع کنترل آلودگی‎ها در شرایط کشت بافت شاید مهم‎ترین مساله در مورد کشت بافت نمدار و یا هر گیاهی باشد که ریزنمونه‎های آن‎ها از محیط خارج، خصوصاً محیط‎های جنگلی گرفته می‎شود که دارای آلودگی‎های فراوانی می‎باشند. با توجه به این مساله که پیش‎سترون‎سازی یک مرحله مقدماتی برای کاهش میزان آلودگی ریزنمونه‎های مورد استفاده در کشت بافت است و با در نظر گرفتن این موضوع که این مرحله در خارج از اتاقک رشد، که استـریــل نمی‎باشــد، انجــام می‎گیــرد، نمی‎تــوان پیش‎سترون‎سازی را به عنوان یک مرحله مستقل در محاسبات وارد نمود، اما با توجه به تجربیات به دست آمده در این تحقیق و با علم به این موضوع که نمی‎توان اثر پیش‎سترون‎سازی را از محاسبات حذف نمود، این مرحله به عنوان یک پیش نیاز برای مرحله سترون‎سازی در نظر گرفته شد و از قارچ کش جهت کاهش آلودگی‎های قارچی فراوان موجود در کشت ها استفاده گردید. در رویش‎گاه مورد مطالعه قارچ‎های  Penicillium sp.،sp  Fusarium وsp. Alternaria  همراه بذور نمدار جداسازی و شناسایی شده بود (10). استفاده از قارچ‎کش کاهش چشم‎گیری در آلودگی‎های قارچی به دنبال داشت که با نتایج تحقیق شهرزاد در سال 1376 مطابقت دارد (17). از یازده نوع ریزنمونه مورد بررسی، ساقه حاوی جوانه انتهایی فلس‎دار و جنین جدا شده از بذر، بیش‎ترین میزان جوانه‎زنی را از خود نشان دادند. جوانه انتهایی فلس‎دار نیز در جایگاه بعدی در بین ریزنمونه‎های مورد استفاده از نظر جوانه‎زنی قرار گرفت. ریزنمونه‎های کشت شده به صورت ساقه حاوی جوانه جانبی فلس‎دار، ساقه حاوی جوانه جانبی بدون فلس، بذر کامل و بذر بدون پوسته هیچ گونه جوانه‎زنی از خود نشان ندادند. عدم جوانه‏زنی در بذور کشت شده بدون پوسته به علت وجود موسیلاژ و مواد فنولی فراوان بوده است. موسیلاژ‏ها باعث جلوگیری از ارتباط بین ریزنمونه و محیط کشت شده و مواد فنولی، قهوه‏ای شدن محیط کشت و ایجاد آلودگی بیش از حد را به دنبال دارند. این عوامل باعث عدم جوانه‏زنی و بیشترین میزان آلودگی در این ریزنمونه‎ها می‎شون  (17). عدم جوانه‎زنی ساقه حاوی جوانه جانبی در هر دو حالت فلس‎دار و بدون فلس، شاید به دلیل وجود دو محل قطع ساقه در بالا و پایین جوانه جانبی ‎و نتیجتا افزایش میزان ترشحات مواد فنولی باشد. استفاده از اسیداسکوربیک در مرحله پیش‎سترون‎سازی و سترون‎سازی به تنهایی نمی‎تواند جلوی ترشح کامل مواد فنولی را بگیرد و باعث آلودگی در محیط کشت می‎شود. ضمن این‎که به علت عدم تماس مقطع بالایی ساقه با محیط کشت، جذب مواد از محیط کشت کاهش یافته و اسیداسکوربیک کمتری جذب ریزنمونه می‎شود، اسیداسکوربیک نمی‎تواند نقش اصلی خود یعنی کاهش مواد فنولی را ایفا نماید. بر اساس اطلاعات موجود، سفت و سخت بودن پوسته (پریکارپ) بذر نمدار که مانع از جذب آب، گازها و نور می‏شود به عنوان یک عامل فیزیکی از جوانه‏زنی بذر جلوگیری می‏کند یا باعث تاخیر آن می‏شود (20). این عامل مانع ارتباط بین بذر و محیط کشت شده و به علت عدم جذب عناصر لازم توسط بذر کامل در محیط کشت جوانه‏زنی صورت نمی‎گیرد، این موضوع حتی در مورد بذوری که پوسته‏شان هنوز به اندازه کافی تکامل نیافته‎اند نیز صدق می‏کند. ممکن است عوامل هورمونی موجود در پوسته بذر نمدار باعث این عامل باشد که باید در تحقیقی جداگانه به آن پرداخته شود. در تحقیق حاضر مناسب‎ترین ریزنمونه ها، جنین و  تک گره‎های حاوی جوانه انتهایی دارای فلس تشخیص داده شد. Chalupa نیز در سال 2003 از ریزنمونه‎های تهیه شده از بذر، در کشت بافت نمدار با استفاده از بافت‎های جنینی توانست باززایی نرمال و متناسبی به‎دست آورد که با نتایج این تحقیق مطابقت دارد (6). Yahyoglu و Ucler در سال 1995 در تکثیر T.rubra به نتایج کاملاً متفاوتی با نتایج حاصل از این تحقیق دست یافتند، به طوری که از جنین بذر هیچ گونه جوابی نگرفتند، در صورتی که از بذر بدون پوسته توانستند ریشه‎زایی بگیرند که نتایج‎شان در نوع خود منحصر به فرد می‎باشد (21). شهرزاد در سال 1376 بهترین نوع ریزنمونه را در گونه Tilia platyphyllos، جوانه انتهایی و نزدیک انتهایی تعیین نمود (17). Chalupa نیز در سال 1988 بعد از چندین سال بررسی بر روی T.cordata، جوانه‎های انتهایی را به عنوان بهترین ریزنمونه معرفی نمود. Sarvasova و Durkovic در سال 2002 در ریزازدیادی T.europea بهترین نوع ریزنمونه را جوانه جانبی معرفی کردند که با نتایج حاصل از این تحقیق مغایرت دارد (15).

دو نوع ریزنمونه اصلی که بیشترین میزان جوانه‎زنی را از خود نشان دادند، یعنی جنین و ساقه حاوی جوانه انتهایی فلس‎دار در محیط کشت‎های حاوی هورمون‎های مختلف کشت و داده‎های حاصل مورد بررسی قرار گرفتند. بیشترین میزان ساقه‎زایی در محیط کشت حاوی 1/0 میلی‎گرم بر لیتر IBA بود و محیط‎کشت‎های کد 3 ( 1/0 میلی‎گرم بر لیتر IBA  با یک میلی‎گرم بر لیتر کینتین) و کد 4 (1/0 میلی‎گرم بر لیتر IBA با 2 میلی‎گرم بر لیتر کینتین) و هم‎چنین کد 1 ( 2/0 میلی‎گرم بر لیتر IBA با یک میلی‎گرم بر لیتر کینتین) در رتبه‎های بعدی از نظر بیشترین میزان جوانه‎زنی و نهایتا ساقه‎زایی قرار گرفتند. Chalupa در سال 2003 به این نتیجه رسید که با کاهش غلظت سیتوکنین و افزایش هورمون گیاهی IBA تکثیر ساقه سرعت بیشتری پیدا می‎کند که این موضوع با نتایج حاصل از این تحقیق مطابقت‎ دارد (7). شهرزاد (1376) نیز بهترین تنظیم کننده رشد را  IBA با غلظت1/0 میلی‎گرم بر لیتر معرفی نمود، اگرچه بهترین محیط کشت را WPM  تعیین کرد (17). شایان ذکر است که در تحقیق انجام شده توسط کنتسا و همکاران (2011) بر روی گونه ای از فندق نیز IBA اثرات معنی داری بر روی جوانه زنی و تشکیل جوانه داشته است (22).

   با وجود اعمال تیمارهای مختلف ریشه‎زایی حاصل نشد ولی Sarvasova و Durkovic  (2002) به راحتی و فقط با اعمال هورمون NAA توانستند ریشه‎‎‎‎‎زایی خوبی در مورد گونهT. europea  به دست آورند (15). این مرحله احتیاج به تحقیق بیشتر و تیمارهای ریشه‎زایی بیشتری خواهد داشت.

نتیجه گیری: در این مطالعه، پروتکل تکثیر و ریزازدیادی گونه نمدار در شرایط درون شیشه ای ارایه شد. این نتایج به منظور اهداف متفاوتی از قبیل تکثیر انبوه، مطالعات پایه در کارهای اصلاح نژاد و مولکولی به‎خصوص در تولید گیاهان تراریخته می‎تواند مورد استفاده قرار گیرد.

منابع

1. Salehi, M., Hosseini, B., Jabbarzadeh. Z. (2014). High–frequency in vitro plantlet regeneration from apical bud as a novel explant of Carum copticum L. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. Vol. 4, No. 1, pp. 424-428.

1. Froutan, A., Vadidar, (2006). Plant tissue culture. Sepehr publication center, pp. 296
2. Sabeti, H. (1995). Trees and shrubs of Iran. Yaz university Press, pp. 750
3. Sadati, S.E., Emadian, S.F., Jalilvand, H., Mokhtari, J., Tabari, M. (2007). Influence of Some Topographic Factors on Distribution of Large-Leaved Lime (Tilia platyphyllos Scop.) in Vaz Forest. JWSS - Isfahan University of Technology, Vol. 11, No. 41, pp. 443-452
4. Kunneman, B.P., Albers, M.R.J. (1991). Linden trees (Tilia spp.). In: Bajaj YPS, ed. Biotechnology in agriculture and forestry. Trees, Vol. 3, No. 16, pp. 152-163
5. Barker, W. (1969). Behavior in vitro of plant cells from various sources within the same organism. Can. J. Bot, Vol. 47, pp. 1334-1336
6. Mehrdad, M., Payamnour, V., Ghasemi Bezdi, K., Kavousi, M.R., Zhand, S. (2010). Isolation and Identification of fungi associated with seeds using in tilia species (Tilia begonifoila).
7. Mala, J., Machova, P.,  Cvrckova, H. (2001). Micropropagation of linden. Zpravy Lesnickeho Vyzkumu, Vol. 46, No. 3, pp. 147-149
8. Shahrzad, Sh. (1997). Tilia (Tilia platyphyllos) Micropropagation through tissue culture. Final report of research. Research Institute of Forests and Rangelands.
9. Tabari, M., Tabandeh, A. (2007).  Germination response of treated seed of tilia to irrigation and seed culture depth. Iranian Journal of Forest and Poplar Research, Vol. 15, No. 2, pp. 144-151
10. Spaeth, J.N. (1934). A physiological study of dormancy in Tilia seed. Cornell University Agricultural Experiment Station Memoir, Vol. 169, p. 1-71

4. Edlin, H.L.)1976). Trees. pp. 224
5. Haller, J.M. (1995). Tilia americana, linden: a neglected jewel. Arbor Age, Vol. 15, No. 7, pp. 32-33

7. Chalupa, V. (2003). In vitro propagation of Tilia platyphyllos by axillary shoot proliferation and somatic embryogenesis.

11. Chalupa, V. (1984). In vitro propagation of oak (Quercus robur L.) and linden (Tilia cordata Mill.).The Journal of the Biologia Plantarum, Vol. 26, No. 5, pp. 374-377
12. Chalupa, V. (1988). In vitro propagation of small-leaved linden (Tilia cordata), black locust (Robinia pseudoacacia) and mountain ash (Sorbus aucuparia) and growth of trees cultivated in vitro. The Journal of the Lesnictví, Vol. 34, No. 8,  pp. 705-720
13. Yahyaoglu, Z., Ucler, A.O. (1995). In vitro plantlet regeneration from embryos of Caucasian linden (Tilia rubra). Turkish Journal of Agriculture & Forestry, Vol. 19, No. 4, pp. 231-235

15. Sarvasova, I., Durkovic, J. (2002). In vitro regeneration of European linden.The Journal if the Biologia Plantarum, Vol. 45, No. 1, pp. 149-152
16. Mauleova, M., Vítamvas, J.,  Tusek Z. (2004). In vitro propagation of important deciduous forest tree species. Zpravy Lesnickeho Vyzkumu, Vol. 49, No. 1/4, pp. 3-6

18. Mitsukuri, K., Mori, G., Johkan, M., Shimada, Y., Mishiba, K.-I. , Morikawa, T., Oda, M. (2009). Effects of explant position and dark treatment on bud formation in floret culture of Ponerorchis graminifolia Rchb.f. Vol. 121. No. 2. Pp. 243-247.

21. Ucler, A.O.,  Mollamehmetoglu, N.  (2001). In vitro plantlet regeneration from mature embryos of linden (Tilia platyphyllos Scop.) and multiplication of its buds. Turkish Journal of Agriculture & Forestry, Vol. 25, No. 3, pp. 181-186.