بررسی سمیت غلظت‌های تحت کشنده نیترات نقره بر برخی شاخص های هماتولوژی و ایمونولوژی ماهی قرمز (Carassius auratus)

علوم و تکنولوژی محیط زیست، دوره نوزدهم،ویژه نامه شماره 5 ، تابستان1396

بررسی سمیت غلظت­های تحت کشنده نیترات نقره  بر برخیشاخص های هماتولوژی و ایمونولوژی ماهی قرمز (Carassius auratus)

صفورا ابرقویی [1]*

Sabarghoei67@gmail.com

سید علی اکبر هدایتی[2]

رسول قربانی[3]

حامد کلنگی میاندره[4]

طاهره باقری[5]

چکیده

زمینه و هدف: در میان آلاینده­های فلزی، یون نقره بسیار سمی است و بالاترین درجه سمیت را در رده بندی مواد سمی به خود اختصاص داده است. امروزه ترکیبات نقره به دلیل خواص ضد میکروبی در صنایع مختلف استفاده می­گردند. اما اثرات غیرقابل بازگشت فلزات سنگین غیرضروری همانند نقره، در بدن آبزیان غیر قابل بازگشت می­باشد. در مطالعه حاضر به بررسی اثرات تحت کشنده نیترات نقره بر پارامترهای خون شناسی و ایمنی  شناسی ماهی قرمز(Carassius auratus) به عنوان گونه مدل کپور ماهیان پرداخته شد.

روش بررسی: تعداد 105 قطعه ماهی قرمز، به صورت تصادفی در 15 مخزن فایبرگلاس (400 لیتری) قرار گرفتند (12 مخزن برای غلظت­های مختلف نیترات نقره و3 مخزن به عنوان گروه شاهد) و برای آزمون های بیوشیمیایی وخون شناسی تیمارها، 9 ماهی به طور تصادفی از هر تیمار انتخاب شد که به طور جداگانه در معرض غلظت­های موثر  ppm 01/0، 025/0، 05/0 و 1/0نیترات نقره قرارگرفتند. شاخص­های مورد اندازه­گیری شامل: تعداد کل گلبول­های سفید (لوکوسیت)، لنفوسیت، نوتروفیل، ائوزینوفیل، تعداد کل گلبول­های قرمز (اریتروسیت)، محتوای هموگلوبین، سطح هماتوکریت، حجم متوسط گلبولی (MCV)، وزن هموگلوبین داخل گلبولی (MCH)، درصد غلظت هموگلوبین داخل گلوبولی و گلوکز سرم بود.

بحث و نتیجه‌گیری: نتایج آزمایش نشان داد که غلظت­های مختلف نیترات نقره بر روی فاکتور­های اریتروسیتی خون ماهی قرمز در سطح 5/0 معنی دار بود اما بر روی اغلب فاکتور­های لوکوسیتی خون تاثیر چندانی نداشت که امر ممکن است به دلیل مقاوم بودن این ماهی نسبت به ماهیان دیگر باشد. در نهایت شاخص­های اریتروسیتی خون می­توانند به عنوان بیو­مارکرهای مناسب آلودگی نقره معرفی گردند.

واژه­های کلیدی: آلودگی، ماهی قرمز، خون­شناسی، نیترات نقره، سم شناسی.

Evaluation of the sub-lethal effects of silver nitrate (AgNO₃) concentration toxicity on some hematology and immunology indices in goldfish (Carassius auratus)

Safoura Abarghouei[6]*

Sabarghoei67@gmail.com

Seyed Ali Akbar Hedayati[7]

Rasoul Ghorbani[8]

Hamed Kolangi Miyandareh[9]

Tahereh Bagheri[10]

Abstract

Background and Objective: Among metal pollutants silver ions are the most toxic forms, and have been assigned to the highest toxicity class. Today, due to the antibacterial properties of silver compounds they  are used in various industries. The effects of non-essential heavy metals such as silver are irreversible on aquatic animals’ body. In the present study, the sub-ethal effects of silver nitrate on hematology and Immunology parameters of goldfish (Carassius auratus) as a model species in Cyprinidae family were investigated.

Method: 105 fish werer randomly placed in 15 fiberglass tanks (400 liters); 12 tanks were used for different concentrations of silver nitrate and 3 tanks were used for control groups. The fishe of each treatment were separately exposed to effective silver nitrate concentrations of 0.01, 0.025, 0.05 and 0.1 ppm, and for hematological and biochemical test, nine fish were randomly selected from each treatment. Measured indices were total number of white blood cells (leukocytes), lymphocytes, neutrophils, eosinophil, total number of red blood cells (erythrocytes), hemoglobin content, hematocrit level, mean corpuscular volume (MCV), hemoglobin the corpuscular (MCH), hemoglobin concentration and serum glucoses.

Conclusion: The results showed that different concentrations of silver nitrate influenced blood erythrocyte (P>0.05) but did not affect blood leukocyte, which may be due to the resistance of the gold fish compared to others. Blood could be introduced as a suitable biomarker of silver pollution.

Keywords: Pollution, Carassius auratus, hematology, silver nitrate, Toxicology.

مقدمه

میزان نقره در پوسته زمین در حدود 1/0 گرم در هر تن می­باشد (1). در میان آلاینده های فلزی، یون نقره بسیار سمی است و بالاترین درجه سمیت را در رده بندی مواد سمی به خود اختصاص داده است . سمی بودن آن برای طیف وسیعی از میکروارگانیسم ها و هم­چنین سمیت کم آن برای انسان منجر به توسعه تعداد زیادی از محصولات بر پایه نقره شده است(2). اثر باکتریایی یون نقره بر روی بسیاری از موارد مورد مطالعه قرار گرفته است (3). یون نقره به طور گسترده در مراقبت­های بهداشتی برای کنترل میکروارگانیسم­ها به ویژه در سیستم تأمین آب مورد استفاده قرار می­گیرد و به دلیل این­که هیچ گونه تاثیر نامطلوب بر رنگ، بو و طعم آب ندارد بسیار مورد توجه است (4).

 نقره عمدتاً، به‌دلیل خواص فیزیکی و شیمیایی ویژه‌ای که از خود نشان می‌دهد در مصارف الکترونیکی، نوری، دارویی و بهداشتی کاربرد فراوان دارد (5) نیترات نقره به عنوان عامل ایجاد کننده گروه های فعال اکسیژنی (ROS) شناخته شده و به وسیله مکانیسم­های متنوع، شامل بر هم کنش با گروه­های سولفیدریل پروتئین­ها و آنزیم­ها به سلول آسیب می­رساند. در حالی که بخش وسیعی از نقره در آب­های سطحی به صورت طبیعی وارد می­گردد، فعالیت­های بشری از قبیل معدن، ساخت جواهرات و عکاسی می­توانند سطوح نقره را در آب­های محیطی افزایش دهند (1). تعدادی از مطالعات نشان دادند که نیترات نقره به شدت برای ماهیان آب شیرین سمی است (6). سیستم­های آبی، پیوسته با مشکلات ناشی از آلاینده­هایی مواجه هستند که از منابع مختلف مانند فاضلاب­های صنعتی، پساب­های کشاورزی و فاضلاب­های شهری وارد آن­ها می­شوند. آلاینده­ها (فلزات سنگین، سموم و فرآورده­های نفتی) برای سیستم­ زیستی محیط­های آبی زیان آور بوده و عمدتا بدون هیچ تصفیه­ای به آب­ها وارد می­گردند (7). اکوسیستم آبی در پایین­ترین سطح از ارتفاع قرار دارد در نتیجه مقصد نهایی تمام آلاینده­های محیطی آب است. در نتیجه­ آلوده شدن آب با این مواد و نهایتا با تغذیه از آبزیان در طول زنجیره غذایی به انسان منتقل شده و در طول زمان در بدن موجودات و انسان انباشته می­شود. وجود آن­ها در بدن خطرات جبران ناپذیری را در سال­های طولانی به دنبال دارد (2).

در محیط­های آبی، ماهی به عنوان یک آبزی برای ارزیابی اثر آلاینده­های محیطی در بوم سامانه­های آبی در نظر گرفته می­شود. ماهی در بالاترین نقطه زنجیره غذایی آبی قرار گرفته است و توانایی بزرگنمایی زیستی فلزات سنگین، حتی در غلظت­های پایین موجود در محیط را دارد (8). ماهی قرمز از خانواده کپور ماهیان می­باشد و به لحاظ شرایط زیستی و تغذیه­ای شبیه کپور معمولی است. این ماهی در ایران در حوضه‌های دریای خزر، دریاچه ارومیه و هامون در سیستان و رودخانه کارون پراکنش یافته است. این گونه جهت مطالعات تولید مثلی، سلولی مولکولی، ایمنی شناسی، سم شناسی بسیار مناسب می­باشد، زیرا از اندازه مناسبی جهت تحقیقات آزمایشگاهی برخوردار است و هم­چنین در محیط­های آزمایشگاهی به راحتی قادر به بلوغ و تولیدمثل می­باشد. در واقع از این گونه به عنوان مدل جهت بررسی کپورماهیان استفاده می­شود (9).

خون شاخص مهمی برای وضعیت فیزیولوژیک اندام­های بدن در تشخیص سلامت یا بیماری و کنترل روند زیستی موجودات زنده ازجمله ماهی می­باشد (10). مطالعات خون شناسی روش ارزشمندی برای ارزیابی آثار محیطی آلاینده­ها روی ماهیان می باشد (11). شاخص­های مربوط به خون مانند گلبول­های قرمز و گلبول­های سفید از جمله لنفوسیت­ها، نوتروفیل­ها و مونوسیت­ها یکی از بخش­های سیستم ایمنی غیر اختصاصی سلولی هستند که نوسان در تعداد آن­ها می­تواند به عنوان یک شاخص مناسب در ارتباط با پاسخ ماهیان به عوامل استرس مطرح باشد (12).

با توجه به استفاده­های روز­افزون ترکیبات نقره به دلیل خواص آنتی باکتریال در صنایع مختلف و اثرات غیرقابل بازگشت فلزات سنگین غیر ضروری همانند نقره در بدن آبزیان، و نیز با توجه به این که مطالعات اندکی در رابطه با سمیت نیترات نقره وجود دارد هدف از مطالعه حاضر افزایش اطلاعات در این زمینه و ارزیابی خطر این ماده برای محیط زیست می­باشد. در تحقیق حاضر جهت بررسی اثرات تحت کشنده نمک نیترات نقره بر شاخص­های خون­شناسی و ایمنی­شناسی، ماهی قرمز به عنوان گونه مدل در بررسی خانواده کپور ماهیان انتخاب شد تا از این طریق مارکر خونی مناسبی برای سمیت نیترات نقره مشخص شود.

روش بررسی

در پاییز سال 1392 تعداد 105 قطعه ماهی قرمز، از مرکز فنی حرفه ای آق قلا، با میانگین وزنی. 05/12 ±33/56 گرم تهیه و به مرکز تحقیقات آبزی پروری دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان منتقل شد. ماهی­ها برای انجام آزمایش به صورت تصادفی در 15 مخزن فایبرگلاس (400 لیتری) قرار گرفتند (12 مخزن برای غلظت­های مختلف نیترات نقره و3 مخزن به عنوان گروه شاهد) و برای سازگاری به مدت 2 هفته در شرایط آزمایشگاهی نگهداری شد و با غذای تجاری رایج در بازار، به میزان 2 درصد وزن بدن غذادهی شدند. در دوره سازگاری و آزمایش، آب هوا­دهی و کلر­زدایی شد و مشخصات فیزیکوشیمیایی آب به طور روزانه اندازه­گیری شد. در طول دوره سازگاری و آزمایش ماهیان تحت رژیم نورانی 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی قرار گرفتند. نیترات نقره مورد استفاده از محصولات Merck آلمان در غلظت ppm 5000 در ظرف شیشه ای در بسته تهیه شد.

جهت بررسی اثرات نیترات نقره بر پارامتر­های خونی ماهی قرمز، ماهیان تحت تاثیر 4 غلظت مختلف از محلول­نیترات نقره قرار گرفتند و یک گروه به عنوان شاهد در نظر گرفته شد. انتخاب غلظت­ها، با توجه به مدت زمان آزمایش و پس از تعیین LC₅₀ (سمیت کشندگی حاد) صورت گرفت. نیترات نقره مورد استفاده در مدت 96 ساعت، ppm 184/ اندازه­گیری شد. غلظت­های موثر نیترات نقره به ترتیب  ppm 01/0، 025/0، 05/0 و 1/0 بودند و مدت زمان آزمایش دو هفته بود. هر غلظت ذکر شده به یک مخزن 50 لیتری اضافه شد و پیش از انجام آزمایش آب به مدت 2 دقیقه به شدت هوادهی شد. (در هر تیمار 21 قطعه ماهی و برای هر تیمار 3 تکرار 7 تایی در نظر گرفته شد). آزمایش به طور پویا انجام شد و شرایط فیزیکو شیمیایی آب به طور روزانه کنترل شد. غذادهی در حد سیری و تعویض آب به صورت یک روز در میان با سیفون کردن از کف به اندازه 50 درصد حجم آب انجام شد. هیچ گونه مرگ و میری در طول آزمایش مشاهده نشد و پس از پایان دوره آزمایش، ماهیان به منظور خون­گیری با پودر گل میخک به اندازه 2 گرم در لیتر بیهوش شدند. به دلیل تغییر فعالیت متابولیسمی با تغییر اندازه ماهی و تأتیر بر پارامتر­های بیوشیمیایی خون، سعی شد از ماهی با طول نسبتا مشابه استفاده شود (13).

برای آزمایش­های خون شناسی تیمارها و نمونه شاهد، 9 ماهی به طور تصادفی از هر تیمار انتخاب شد که به طور جداگانه در معرض غلظت­های موثر نیترات نقره قرارگرفته بودند. نمونه شاهد در معرض هیچ غلظتی از نیترات نقره قرار نگرفت. وقتی ماهیان به مرحله بیهوشی عمیق رسیدند، سطح بدن خشک و سپس خون­گیری با قطع ورید ساقه دمی انجام شد به دلیل اینکه خون ماهیان در معرض غلظت­ها به شدت غلیظ شده بود امکان خون­گیری از طریق سرنگ وجود نداشت. نمونه­های خون در لوله­های حاویEDTA  به عنوان ماده ضد انعقاد قرار گرفتند. شاخص­های مورد اندازه­گیری شامل: تعداد کل گلبول­های سفید (لوکوسیت)، لنفوسیت، نوتروفیل، ائوزینوفیل، تعداد کل گلبول­های قرمز (اریتروسیت)، محتوای هموگلوبین، سطح هماتوکریت، حجم متوسط گلبولی (MCV)، وزن هموگلوبین داخل گلبولی (MCH) و درصد غلظت هموگلوبین داخل گلبولی بود (14). شمارش گلبول­های سفید وگلبول­های قرمز به روش هموسیتومتری انجام گرفت (15). مقدار هماتوکریت و غلظت هموگلوبین نیز به روش میکروهماتوکریت و سیانومت هموگلوبین سنجش گردید. به منظور شمارش افتراقی گلبول­های سفید، گسترش خونی بر روی لام تهیه و گسترش­های تثبیت شده با استفاده از رنگ گیمسا رنگ آمیزی شدند.

برای اندازه گیری گلوکز ، گلبول­های قرمز در لوله قرار داده شد و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق (22 درجه سانتی­گراد) فرصت داده شد تا لخته شود. سرم از لخته جدا شد و نمونه پس از سانتریفیوژ در مدت زمان 5 دقیقه در دمای 80- درجه سانتی­گراد منجمد شد تا زمانی که آنالیزها روی آن انجام شود. گلوکز خون به وسیله روش اسپکتوفتومتری (WPAS2000-UV/VIS کمبریج انگلستان)، و با استفاده از کیت پارس آزمون اندازه­گیری شد. اطلاعات حاصله از هر آزمایش با استفاده از نرم افزارSpss 20 و با انجام آزمون ANOVA  یک طرفه و تست توکی در سطح معناداری 5 درصد (05/0P<) مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت. همه نتایج به دست آمده به وسیله میانگین ± انحراف معیار محاسبه شدند.

یافته­ها

طبق بررسی نتایج آماری هیچ گونه اختلاف معنی­دار، در وزن کل و طول کل ماهیان تیمار­های مختلف با گروه شاهد مشاهده نشد (جدول1) (05/0p>). از آنجایی که سعی بر آن بود ماهیان با طول و وزن تقریبی یکسان انتخاب گردند، عدم وجود اختلاف معنی داری در شاخص­های رشد سوماتیک قابل پیش بینی بود. فاکتور­های فیزیکو شیمیایی آب به طور روزانه اندازه­گیری شد و مشخصات فیزیکو شیمیایی به صورت زیر بود: دما= 1 ± 5/19 سانتی­گراد، اکسیژن محلول= 06/. ± 80/8 میلی گرم در لیتر، پی اچ= 45/. ± 56/7، سختی کل= 35/2 ± 293 میلی گرم در لیتر، آب به صورت روزانه تعویض و پارامتر­های کیفی آب دوبار در هفته اندازه­گیری شد (دستگاه اندازه­گیری پی اچ، دما و اکسیژن متر و فتومتر 7100 انگلستان).

جدول1- نتایج زیست سنجی ماهی قرمز در مواجهه با غلظت­های تحت کشنده نیترات نقره

Table 1 - The Result of the biometrics of fishes exposed to sub-lethal concentrations of silver nitrate

*داده­ها به وسیله میانگین± انحراف معیار محاسبه شدند. مقادیر به دست آمده برای هر ویژگی که حداقل دارای یک حرف مشترک می­باشند، از نظر آماری در سطح 5 درصد اختلاف معنی­دار ندارند.

اثر غلظت­های مختلف نیترات نقره بر فاکتور­های خونی ماهی قرمز در جدول­های 2 ارائه شده است. تعداد گلبول­های قرمز گروه شاهد نسبت به غلظت­های مختلف نیترات نقره، کاهش معنی دار داشت (05/0p<). هم­چنین میزان هماتوکریت، کاهش پیدا کرد و بین گروه شاهد با سایر تیمار ها اختلاف معنی­دار وجود داشت (05/0p<). هموگلوبین خون گروه شاهد با سایر غلظت­ها اختلاف معنی­دار داشت و با افزایش غلظت محلول نیترات نقره، کاهش معنی دار پیدا کرد (05/0p<). گلوگز خون روند افزایشی داشت و بین گروه شاهد با غلظت 05/0 اختلاف معنی دار داشت (05/0p<) و در این غلظت به بیشترین مقدار رسید، اما نسبت به سایر غلظت­ها افزایش معنی­دار نداشت (05/0p>). تعداد گلبول­های سفید گروه شاهد با سایر غلظت­ها اختلاف معنی­دار نداشت (05/0p>) اما در بیشترین غلظت­ها (05/0 و 1/0) بیشترین افزایش را داشت. MCHC خون گروه شاهد نسبت به سایر غلظت­ها کاهش یافت (05/0p<.) MCV گروه شاهد، نسبت به سایر غلظت­ها، افزایش یافت (05/0p<)، اما بین غلظت­های مختلف نسبت به هم اختلافی معناداری وجود نداشت (05/0p>). افزایش MCH گروه شاهد نسبت به سایر غلظت­ها به طور معنی­دار نبود (05/0p>). نوتروفیل گروه شاهد فقط در اولین غلظت اختلاف معنی دار داشت اما میزان آن با سایر غلظت­ها اختلافی نداشت (05/0p>). ائوزینوفیل گروه شاهد با سایر غلظت­ها اختلاف معنی دار نداشت (05/0p>). میزان لنفوسیت گروه شاهد نسبت به غلظت­های 01/0 و 025/0 افزایش معنی دار داشت (05/0p<) و در دو غلظت 05/0 و1/0 کاهش پیدا کرد که این میزان کاهش فقط با غلظت 1/0 معنی دار بود (05/0p<) .

جدول 2- میزان پارامتر­های خونی ماهی کاراس طلایی در  مواجه با غلظت­های تحت کشنده نیترات نقره

Table 2-The amount of of blood parameters of gold fish exposed to sub-lethal concentrations of silver nitrate

*داده­ها به وسیله میانگین± انحراف معیار محاسبه شدند. مقادیر به دست آمده برای هر ویژگی که حداقل دارای یک حرف مشترک می­باشند، از نظر آماری در سطح 5 درصد اختلاف معنی­دار ندارند

بحث و نتیجه گیری

نقره یونی، برای موجودات زنده بسیار سمی است (16). هر چند ممکن است اشکال دیگری از نقره وجود داشته باشد که فقط در دسترس موجودات زنده است (17) خاصیت ضد میکروبی آنتی باکتریال این ماده، منجر به گسترش تعداد زیادی از محصولات بر پایه نقره شده است. نقره فلزی است که به دلیل کاربرد فراوان در اشکال مختلف نمک و نانو نقره، به طور گسترده ای در محیط پراکنده شده است. اما در منابع اطلاعاتی موجود، اطلاعات محدودی در رابطه با سمیت نیترات نقره وجود دارد (18).

در مطالعه صورت گرفته روی جامعه پلانکتونی (2) غلظت مورد استفاده نقره، 5 میکروگرم بر لیتر به صورت AgNO₃ بود و غلظت های بالاتر از این مقدار موجب تغییر جامعه پلانکتونی شدند. هم­چنین همه موجودات یوکاریوتی، پس از 24 ساعت قرار گرفتن در معرض 100 میکروگرم بر لیتر نقره از محلول AgNO₃ از بین رفتند. حتی در غلظت 10 میکروگرم بر لیتر نقره از محلول AgNO₃ در مدت یک روز تاژکداران و داینوفلاژله های کمتری نسبت به گروه شاهد زنده ماندند (19) که امر نشان دهنده سمیت بالای این ماده در موجودات زنده است و با مطالعه ژائو و وانگ (4) درسال 2011 هم­خوانی دارد که بیان می­کنند غلظت LC₅₀ برای نیترات نقره، مقدار بسیار کمی است (51/2) میکرو گرم بر لیتر.

 در مطالعه دیگری بر روی سمیت یون نقره که توسط ناوارو و همکاران در سال 2008 انجام شد (20)، گزارش شد که انتشار یون نقره در جلبک سبز کلامیدوموناس (Chlamydomonas reinhardtii) موجب مهار فتوسنتز خواهد شد. اما در هیچ کدام از مطالعات انجام شده سمیت یون نقره در سطح سلولی بررسی نشده است. محیط زیست ماهیان و شرایط حاکم بر آن (نظیر آلودگی) بر مقادیر سلول­های خونی و سایر فاکتور­های خونی تاثیر می­گذارد که این تغییرات می­تواند به عنوان شاخص زیستی مد نظر قرار گیرد. با توجه به اینکه پارامتر­های خونی شرایط نامطلوب محیطی را برای ماهیان سریع­تر از پارامتر­های دیگر نشان می­دهند، تا حد زیادی برای تعیین وضعیت سلامت و نظارت بر پاسخ­های استرسی ماهیان برای پیش بینی سازگاری­های فیزیولوژیکی آن­ها استفاده می­شود (11). زیست آزمونی (Bioassay) روشی است که عکس العمل­های موجودات آبزی برای آشکارسازی، اندازه­گیری یا تأثیر یک یا چند ماده سمی یا عامل محیطی به تنهایی یا توأم با یکدیگر را مورد بررسی قرار می­دهد (21) با استفاده از در معرض قرار دادن ارگانیسم­ها درغلظت­های دوز­های مختلف آلوده کننده، زیست آزمونی برای ارزیابی اثرات سمیت آن­ها انجام می­گیرد که به وسیله پایش خصوصیات و رفتار­های بیولوژیک این ارگانیسم­ها و مقایسه آن با ارگانیسم­های که هیچ گونه مواجه ای با مواد آلوده کننده نداشته اند امکان پذیر می­باشد (22) در زیست آزمونی از موجودات گوناگونی نظیر جلبک، ماهی، باکتری و انواع موجودات آب شیرین نظیر دافنی استفاده می­شود (14). بر این اساس ماهی برای ارزیابی خطر سمیت نیترات نقره انتخاب گردید.

در مطالعه حاضر، تعداد گلبول­های قرمز گروه شاهد، کاهش معنی داری با تمام غلظت­های مختلف نیترات نقره داشت (05/0p<). هم­چنین میزان هماتوکریت، M.C.H.C و هموگلوبین خون کاهش پیدا کرد و بین گروه شاهد با سایر تیمار ها اختلاف معنی­دار وجود داشت (05/0p<).

تحت شرایط استرس زا گلبول­های قرمز نابالغ از طحال آزاد شده و با افزایش متابولیک، اکسیژن رسانی به ارگان­های مهم افزایش می­یابد که به دنبال آن گلبول­های قرمز، غلظت هموگلوبین و سطح هماتوکریت افزایش می­یابد (24و23).

کاسیلاس و همکاران (25) در تحقیقی اثرات استرس بر ماهی قزل آلای رنگین کمان مطالعه کرده و بیان نمودند که استرس به هر دلیلی سبب افزایش هموگلوبین، هماتوکریت و تعداد گلبول های قرمز می­شود. در پاسخ به استرس­های موجود در محیط آبی، کاهش تعداد گلبول­های سفید می­تواند بیانگر سرکوب ایمنی موجود و افزایش میزان آن­ها نشان دهنده پاسخ به استرس یا عفونت باشد (26). در مطالعه حاضر غلظت گلوکز روند افزایش داشت هرچند که این افزایش در همه غلظت­ها معنی دار نبود و فقط و بین گروه شاهد با غلظت 05/0 اختلاف معنی دار وجود داشت (05/0p<). بنابراین می­توان نتیجه گرفت غلظت­های تحت کشنده نیترات نقره عامل ایجاد استرس در ماهی قرمز نیستند.

کاهش شاخص­های اریتروسیتی خون به دلیل کم­خونی رخ می­دهد. در طی کم خونی، کاهش در تعداد گلبول­های قرمز، هموگلوبین و هماتوکریت مشاهده می­شود که ممکن است به دلیل خونریزی، همولیز یا کاهش تولید گلبول­های قرمز صورت پذیرد که با نتایج مطالعه حاضر هم­خوانی دارد (27). شاخص­های لوکوسیتی خون شامل گلبول­های سفید از جمله لنفوسیت­ها، نوتروفیل­ها و مونوسیت­ها یکی از بخش­های سیستم ایمنی غیر اختصاصی سلولی هستند که نوسان در تعداد آن­ها می­تواند به عنوان یک شاخص مناسب در ارتباط با پاسخ ماهیان به عوامل استرس مطرح باشد (24). در پاسخ به استرس­های موجود در محیط آبی، کاهش تعداد گلبول­های سفید می­تواند بیانگر سرکوب ایمنی موجود و افزایش میزان آن­ها نشان دهنده پاسخ به استرس یا عفونت باشد (26). در مطالعه حاضر به جز لنفوسیت بین شاخص­های لوکوسیتی خون ماهی شاهد و سایر غلظت­ها اختلاف معنی­دار وجود نداشت. در این آزمایش ابتدا لنفوسیت در دو غلظت افزایش و سپس کاهش پیدا کرد (05/0p<). لنفوسیت­ها نسبت به سایر لکوسیت­ها طول عمر زیاد­تری دارند و اغلب در مواجهه باآلودگی کاهش پیدا می­کنند. در تحریک یا سرکوب سیستم ایمنی، لنفوسیت­ها بیومارکر­های کارآمدی محسوب ­می­شوند (27) اما در تعداد گلبول­های سفید در بالاترین غلظت­ها (05/0 و 1/0) افزایش مشاهده شد هرچند این تغییرات معنی­دار نبود اما با مطالعات زارچی (28) مطابقت دارد که بیان می­کند بدن، جهت مقابله با نانو ذرات نقره ورودی تولید گلبول­های سفید را افزایش­می­دهد. از آنجایی که افزایش غلظت نیترات نقره، می­تواند موجب تغییر در تعداد گلبول­های سفید شود با افزایش غلظت از 01/0 تا 025/0ppm  گلبول­های سفید کاهش پیدا کرد که با مطالعات چن و همکاران(29) مطابقت دارد که بیان می­کنند افزایش درگیری سلول­ها در فرآیند ایمنی، موجب کاهش سلول­های خونی می­گردد .

به طور کلی نتایج آزمایش حاصل نشان داد که غلظت­های مختلف نیترات نقره بر روی فاکتور­های اریتروسیتی خون ماهی قرمز تاثیر گذار بود (05/0p<)؛ اما بر روی فاکتور­های لوکوسیتی خون تاثیر چندانی نداشت که این مر ممکن است به دلیل مقاوم بودن این ماهی نسبت به ماهیان دیگر باشد علاوه بر این چون یون نقره به تنهایی خاصیت آنتی باکتریال دارد، عدم تاثیر بر اکثر فاکتور­های لوکوسیتی تایید کننده این مطلب است که یون نقره سبب افزایش ایمنی سلولی خواهد شد.

در مجموع با بررسی نتایج آنالیزهای آماری مشخص شد که ماهی کاراس طلایی در مواجهه با غلظت­های مختلف نیترات نقره، در بیشتر شاخص­های اریتروسیتی خون تغییرات معنی دار داشت (05/0p<)؛ بنابراین این شاخص­های اریتروسیتی خون می­توانند به عنوان بیومارکرهای مناسب آلودگی نقره معرفی گردند.

تشکر و قدردانی

این تحقیق با حمایت های مادی و معنوی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان در قالب پایان نامه کارشناسی ارشد صورت گرفت.

منابع

1-   تربالی. ندا، بهاو.ر مائده، عین اللهی. ناهید، نباتچیان. فریبا، بررسی اثر نیترات نقره بر فعالیت آنزیم پرا کسیداز ترب کوهی، 1391، مجله علمی پژوهشی فیض، دانشگاه علوم پزشکی کاشان، صص713-714.

2-      Boenigk, Jens, et al. "Effects of Silver Nitrate and Silver Nanoparticles on a Planktonic Community: General Trends after Short-Term Exposure." PloS one9.4 (2014): e95340.‏

3-      Chambers, C.W., Proctor, C.M., Kabler, P.W., 1962. Bactericidal effect of low concentrations of silver. American Water Works Association 54, 208–216.

4-      Yahya, M.T., Straub, T.M., Gerba, C.P., 1992. Inactivation of coliphage MS-2 and poliovirus by copper, silver, and chlorine. Canadian Journal of Microbiology 38, 430–435.

5-      Gong, P., Li, H., He, X., Wang, K., Hu, J., Tan, W. ... & Yang, X. 2007. Preparation and antibacterial activity of Fe3O4@ Ag nanoparticles. Nanotechnology, 18(28), 285604.

6-      Davies, P.H., Goettl,  Jr.,  J.P.  And Sinley,  J.R.,  1978.  Toxicity of silver to rainbow trout (Salmo gairdneri). Water Res., 12:  113-117.

7-   شاهسونی. داور، مهری. مهرداد، نظری. کوروش 1382. بررسی تأثیر ماده شوینده آنیونی (شامپو) بر پارامترهای خونی ماهی حوض (Carassius auratus) پژوهش و سازندگی.

8-      Bhagwant, S.and Bhikagee, M. 2000. Induction of hypochromic Macrocytic Anemiain Oreohromis hybrid (Cichlidae) exposed to 100mg/L (sub lethal dose) of Aluminum. Science and Technology- Research Journal.

9-      Lee, L.E., Caldwell, S.J. and Gibbons, J. 1997. Development of a cell line from skin of goldfish (Carassius auratus), and effects of ascorbic acid on collagen deposition. Histochemistry and Cell Biology. 29: 31–43.

10-  Mojabi, A. (2000). Veterinary clinical biochemistry. Noorbakhsh Press, Tehran, Iran, 477, 479.‏ (In Persian).

11-  Luskova, V., Halacka, K., & Lusk, S. 1995. Dynamics of the haemogram in the nase, Chondrostoma nasus. Folia Zoologica, 44, 69-74.‏

12-  Stoskopf, M.A. 1993. Fish medicine. Sounders Company, U.S.A, 882p.

13-  Cicik, B. and Engin, K. 2005. The effects of cadmium on levels of glucose in serum and glycogen reserves in the liver and muscle tissues of Cyprinus carpio (L., 1758). Turk J Vet Anim Sci. 29:113-117.

14-  U.S.Environmental Protection Agency. Methods for measuring the acute toxicity of effluents and receiving waters to fresh water and marine organisms [Online]. 2002; Available from: URL:

www,water.epa.gov/scitech/methods/cwa/wet/disk2_index.cfm/

15-  Rabitto, I. S., Alves Costa, J. R. M., Silva de Assis, H. C., Pelletier, E., Akaishi, F. M., Anjos, A., ... & Oliveira Ribeiro, C. A. (2005). Effects of dietary Pb (II) and tributyltin on Neotropical fish, Hoplias malabaricus: histopathological and biochemical findings. Ecotoxicology and environmental safety, 60(2), 147-156.

16-  Hogstrand C, Wood C.Toward a better understanding of the bioavailability, physiology, and toxicity of silver in fish: implications for water quality criteria. Environ Toxicol Chem 1998; 17:547–61.

17-  Campbell PGC, Errécalde O, Fortin C, Hiriart-Baer VP, Vigneault B.Metal bioavailability to phytoplankton —applicability of the biotic ligand model. Comparative biochemistry and physiology. Toxicol Pharmacol CBP CBP 2002;133:189–206

18-  Mueller, N. C., & Nowack, B. (2008). Exposure modeling of engineered nanoparticles in the environment. Environmental Science & Technology, 42(12), 4447-4453.‏

19-  Hund-Rinke, K., Marscheider-Weidemann, F., Kemper, M., & Simon, M. (2008). Beurteilung der Gesamtumweltexposition von Silberionen aus Biozid-Produkten.UBA Texte, 43(08).‏

20-  Navarro E, Piccapietra F, Wagner B, Marconi F, Kaegi R, Odzak N, et al.Toxicity of silver Nanoparticles toChlamydomonas reinhardtii. Environ Sci Technol 2008b; 42:8959–64.

21-  Martins J, Oliva TL, Vasconcelos V. Assays with Daphnia magna and Danio rerio as alert systems in aquatic toxicology. Environ Int 2007; 33(3): 414-25

22-  Nadafee K. Bioassay with micro organism, review article. J Shaheed Sadoughi Univ Med Sci 1995.

23-  Molinero, A., & Gonzalez, J. 1995. Comparative effects of MS 222 and 2-phenoxyethanol on gilthead sea bream (Sparus aurata L.) during confinement. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology, 111(3), 405-414

24-  Shaluei, F., Hedayati, A., Jahanbakhshi, A., & Baghfalaki, M. 2012. Physiological responses of great sturgeon (Huso huso) to different concentrations of 2-phenoxyethanol as an anesthetic. Fish physiology and biochemistry, 38(6), 1627-1634

25-  Casillas, E., Smith, L.S.,1974. Effects of stress on blood coagulation and haematology in rianbow trout exposed to hypoxia, J.Fish Biol. 6, 379-380.

26-  Adams, S. M. 2002. Biological indicators of aquatic ecosystem stress. American Fisheries Society.

27-  هدایتی. ع، جهانبخشی. ع، قادری رمازی،.ف، 1392، سم شناسی آبزیان، جلد اول، چاپ اول، صص  70_76.

28- رضایی زارچی. س،1390، اثر نانو ذرات اکسید تیتانیوم روی میزان سلول­های خونی و آنزیم­های کبدی در خون رت نژاد ویستار، مجله علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد، صص 626-618.

29-  Chen, Z., Meng, H., Xing, G., Chen, C., Zhao, Y., Jia, G, Wan, L. 2006. Acute toxicological effects of copper nanoparticles in vivo. Toxicology letters, 163(2), 109-120.‏